劉 蔚常 杰武毅君* 馬云峰

1. 河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 開封 475000; 2. 河南大學(xué) 藥學(xué)院，河南 開封 475004; 3. 河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 開封 475004

健骨痛消丸含有杜仲、熟地、枸杞子、山茱萸、淫羊藿等成分，具有補(bǔ)益肝腎、軟堅散結(jié)、活血止痛等功效。杜仲科植物杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)是我國傳統(tǒng)中藥，具有抗腫瘤、降血壓、抗菌、抗血栓等藥理作用，其干燥樹皮，具有補(bǔ)肝腎強(qiáng)筋骨、安胎之功，用于腎虛腰痛，筋骨無力等病癥[1-4]。我們以其活性成分松脂醇二葡萄糖苷(PDG)、京尼平和京尼平苷含量作為技術(shù)參數(shù)，制訂健骨痛消丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)用高效液相色譜法測定杜仲中主要活性成分的方法已有文獻(xiàn)報道[5-8]，我們采用高效液相色譜-示差折光檢測法(HPLC-RID)對健骨痛消丸中PDG、京尼平和京尼平苷含量進(jìn)行定量檢測。通過對比該方法與高效液相色譜紫外檢測器的檢測結(jié)果，檢驗該方法的可靠性與準(zhǔn)確性。并且了解健骨痛消丸提取液及活性成分的抗凝血作用。

1 儀器及試劑

Waters HPLC ( Milford， Massachusetts，USA):泵Waters1515 ， 自動進(jìn)樣器 Waters 2707，檢測器Waters UV/Visible Detector 2489， Waters Refractive Detector 2414， Elite C18色譜柱 (250×4.6 mm i.d.， 5 μm);酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific Oy， Finland)。

凝血活酶時間(APTT)測定試劑盒、凝血酶原時間(PT)測定試劑盒、凝血酶時間(TT)測定試劑盒，武漢中太生物科技有限公司。松脂醇二葡萄糖苷，京尼平和京尼平苷對照品，購自上海源葉生物技術(shù)有限公司(CAS 型號:63902-38-5，HPLC≥98%)。健骨痛消丸樣品為自制水丸樣品。甲醇為色譜純; 水為超純水，其他試劑均為分析純。

實驗動物:SD 大鼠，體質(zhì)量180 ～ 220 g，均為清潔級;來源:河南省實驗動物中心;許可證號:SCXK-2017-0001。

2 PDG、京尼平和京尼平苷含量的測定

2.1 紫外掃描

將標(biāo)準(zhǔn)品配成合適的濃度，從210 nm 到360 nm 波長進(jìn)行掃描，測出其紫外最大吸收波長。

2.2 色譜條件

流動相，水、甲醇體積比 = 30∶70。 進(jìn)樣量=20.0 μL， 溫度=30 ℃， 流速=0.8 mL/min。樣品分別經(jīng)過紫外檢測器和示差折光率檢測器。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取PDG、京尼平和京尼平苷對照品10.8、10.5和10.2 mg，加甲醇定容至10.0 mL，制成1 mL 含PDG、京尼平和京尼平苷分別為1.08、1.05和1.02 mg的母液，通過稀釋即得各種濃度的溶液。

2.4 檢測限和定量限

2.4.1 檢測限

以對照品峰信噪比( S/N) 為 5 時計算，確定PDG、京尼平和京尼平苷檢測限分別為0.021 6、0.063 2 、0.018 6 mg/mL。

2.4.2 定量限

按對照品峰信噪比( S /N) 為 10 時計算，確定PDG、京尼平和京尼平苷的檢測限為0.047 5、0.014 6、0.040 9 mg/mL。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將PDG、京尼平和京尼平苷母液分別稀釋成為不同濃度的溶液，按上述確定的色譜條件進(jìn)行測定，以峰面積積分值(Y) 為縱坐標(biāo)，對照品的濃度 (X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到PDG 的線性回歸方程Y= 0.142X-0.0004 (R2= 0.9999)，京尼平的線性回歸方程Y=0.003X+ 0.001 (R2=0.9970)，京尼平苷的線性回歸方程Y= 0.011X+ 0.002(R2= 0. 9940)。

2.6 精密度實驗

準(zhǔn)確吸取同一對照品溶液，同一天連續(xù)測定 5次，測定PDG、京尼平和京尼平苷的峰面積，計算RSD 分別為 0.58%、0.46%和0.62%。上述對照品分別測定3 d，每天測定 5 次，測定PDG、京尼平和京尼平苷的峰面積，計算 RSD 分別為 1.02%、1.23%、1.14% 。

2.7 供試品溶液的制備

藥品水丸適量，研細(xì)，稱取10.0 g， 用氯仿回流提取6 h，抽濾后固體物再用甲醇(固液比1∶10)60 ℃加熱攪拌回流提取 2 h，抽濾，藥渣再按照同樣方法繼續(xù)提取，如是4次，濾液定容。以不用氯仿回流提取作為對照，同樣連續(xù)提取4次發(fā)現(xiàn):第2次提取的京尼平，第3次提取的京尼平苷，第4次提取出PDG 含量可以忽略不計。所以連續(xù)提取樣品3次可以將水丸中的PDG、京尼平和京尼平苷基本提取完全。

2.8 重復(fù)性實驗

取同一批號樣品(批號150723) 3份，按 2.6 項下操作，在上述色譜條件下進(jìn)行測定，計算PDG、京尼平和京尼平苷色譜峰的峰面積，RSD 分別為2.41%、3.24%、3.46%

2.9 加樣回收率實驗

取已知PDG、京尼平和京尼平苷含量的健骨痛消丸( 水丸) 粉末(批號150723) 約 1.0 g，精密稱定 9 份，每 3 份加入相同體積的標(biāo)準(zhǔn)液(分別為0.10、0.20、0.30 mL) 的PDG、京尼平和京尼平苷對照品，按供試品溶液制備項下方法操作，測定。計算PDG、京尼平和京尼平苷回收率及 RSD 分別為102.4%、3.9%; 99.2%、2.8%;101.6%、3.2%。

2.10 健骨痛消丸中PDG、京尼平和京尼平苷的含量

稱取質(zhì)量相近健骨痛消丸樣品，按照上述提取方法，同時采用高效液相色譜紫外檢測器與示差折光率檢測器測定成藥中PDG、京尼平和京尼平苷的含量。

2.11 健骨痛消丸提取液及其活性成分抗凝血實驗

以活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT) 3個體外抗凝血指標(biāo)作為檢測指標(biāo)，對溶液提取物抗凝血效果進(jìn)行研究。

2.11.1 動物血漿的制備

選擇SPF級大鼠，眼眶取血，稱取380 mg的檸檬酸鈉用10 mL生理鹽水溶解配置成濃度為0.109 mol/L的檸檬酸鈉抗凝劑，血液與抗凝劑的體積比為9∶1，3 000 r/min離心15 min，取上層血漿備用。以等量的生理鹽水(9 g/L)作為陰性對照組。

2.11.2 活化部分凝血活酶時間(APTT)的測定

取血漿100 μL，藥液100 μL 和100 μL APTT試劑加入凝血槽中加鋼珠混勻，各設(shè)置3個復(fù)孔，37℃孵育3 min后加入預(yù)溫10 min的CaCl2100 μL，用凝血分析儀測定其凝固時間。

2.11.3 凝血酶原時間(PT)的測定

取血漿100 μL，藥液100 μL 加入凝血槽中加鋼珠混勻，各設(shè)置3個復(fù)孔，37 ℃孵育3 min后加入預(yù)溫10 min的PT 試劑100 μL，用凝血分析儀測定其凝固時間。

2.11.4 凝血酶時間(TT)的測定

取血漿100 μL，藥液100 μL 加入凝血槽中加鋼珠混勻，各設(shè)置3個復(fù)孔，37 ℃孵育3 min后加入預(yù)溫10 min的TT 試劑100 μL，用凝血分析儀測定其凝固時間。

2.12 統(tǒng)計分析

平行3次實驗求均值和方差。T-test采用雙尾檢驗，以P＜ 0.05作為顯著性水平標(biāo)準(zhǔn)檢測。

3 結(jié)果與討論

目前，高效液相色譜測定藥品中有效成分含量的方法通常采用的都是在不同波長下的紫外檢測[2-8]。研究所涉及杜仲有效成分的最大紫外吸收波長都不相同，PDG 有2個吸收峰，分別在227 nm和277 nm 附近，京尼平的最大吸收波長在240 nm，京尼平苷的最大吸收波長在238 nm(圖1)，這就會引起檢測的不便。示差折光率檢測器的檢測范圍具有廣泛性，可用于檢測糖類、聚合物等物質(zhì)[9-10]。PDG、京尼平和京尼平苷含有共軛結(jié)構(gòu)，因此這些物質(zhì)既可用紫外檢測，又可用示差折光率檢測器進(jìn)行檢測。

圖1 PDG、京尼平和京尼平苷標(biāo)準(zhǔn)品紫外掃描圖譜

由于樣品先經(jīng)過紫外檢測器，后經(jīng)過示差折光率檢測器，所以其的出峰時間比紫外吸收的出峰時間晚(圖2)。同時也可看出，相同質(zhì)量濃度的京尼平的紫外吸收峰面積比京尼平苷的峰面積大，而示差折光率檢測的峰面積卻比京尼平苷的小，這說明示差折光率檢測器對含有糖基的物質(zhì)的更靈敏，從檢測限及回歸方程的自變量的系數(shù)(表1)也可以得出類似的結(jié)論。

采用HPLC-RID 可同時測定不同有效物質(zhì)的含量，避免了不同有效物質(zhì)最大吸收波長不同對實驗造成的不利影響。通過精密度實驗，重復(fù)性實驗和加樣回收率實驗，表明HPLC-RID 的測定結(jié)果是可靠的。采用HPLC-RID 法測定成藥中PDG、京尼平和京尼平苷的含量分別為(3.52±0.085)mg/g、(32.6±1.6)μg/g、(221±9.5) μg/g，與HPLC-UV檢測方法相比，結(jié)果無顯著性差異(表1)。 對健骨痛消丸提取有效成分前，采用氯仿處理可以有效提高PDG、京尼平和京尼平苷的提取效率(圖3)，推測是由于氯仿可以除去杜仲膠從而使得有效成分可以更有效的釋放出來。

體外抗凝血活性實驗中， APTT、PT 和TT 是醫(yī)學(xué)上常用來確定凝血途徑的三項指標(biāo)，燈盞花素為中藥提取制劑，主要有抗凝血、抗血栓形成，改善血液流變性及微循環(huán)，增加腦血流量，抗心肌缺血，提高機(jī)體耐缺氧能力等作用[11-12]。

圖2 PDG、京尼平和京尼平苷標(biāo)準(zhǔn)品高效液相圖譜(a： HPLC-UV;b：HPLC-RIS)

表1 HPLC-RID 與HPLC-UV 檢測樣品中PDG、京尼平和京尼平苷含量的比較

實驗的抗凝血實驗表明，健骨痛消丸提取液的PT、APTT、TT 實驗的值顯著大于陰性對照組和燈盞花素;幾種檢測出的活性成分中，京尼平的PT 活性最強(qiáng);幾種活性成分APTT 活性均強(qiáng)于對照(表2)，提取液的抗凝血作用比單一活性成分強(qiáng)推測是由于幾種成分聯(lián)合作用的結(jié)果，也可能是由于丸劑中的其他成分在起作用;幾種活性成分的TT 實驗值顯著小于對照，而提取液實驗值大于對照，可能是由于丸劑中的其他成分在起作用。 血栓的形成涉及到機(jī)體的凝血功能、血小板凝聚功能等多種因素，目前抗血栓藥物的研究主要集中在對血液流變學(xué)、凝血系統(tǒng)、抗凝系統(tǒng)、纖溶系統(tǒng)及對血小板的影響等方面[13]。健骨痛消丸提取液可明顯延長凝血時間，和PT、APTT 和TT 值，從而發(fā)揮抗凝血作用，其活性優(yōu)于燈盞花素，而燈盞花素具有抗凝血、抗血栓形成的作用，健骨痛消丸可能也具有相似的作用。

表2 健骨痛消丸中活性成分及提取液的抗凝血作用

圖3 健骨痛消丸中PDG、京尼平和京尼平苷提取效果的比較

4 結(jié)論

HPLC-RIS 可以同時測定最大吸收波長不同的幾種有效物質(zhì)，而且方法簡單，結(jié)果可靠。從京尼平和京尼平苷這兩種物質(zhì)的檢測中可知，示差折光率檢測器對含有糖基類物質(zhì)更為敏感，檢測限更低。所以，HPLC-RIS更適合用來檢測含有糖基類的物質(zhì)。健骨痛消丸中，PDG 含量最高，京尼平苷次之，京尼平含量最少。對健骨痛消丸提取前采用氯仿處理，可以使活性成分提取更為有效。健骨痛消丸提取液的PT、APTT、TT實驗顯著優(yōu)于對照，京尼平的PT 活性最強(qiáng)，幾種活性成分APTT活性均優(yōu)于對照，提取液的抗凝血作用比單一活性成分強(qiáng)可能是優(yōu)于濃度較高可能是由于幾種成分聯(lián)合作用的結(jié)果。