鄒秀明，印懷文

（1.長沙牧康生物科技有限公司，湖南 長沙 410128；2.湖南省辰溪縣畜牧水產(chǎn)局，湖南 懷化 419500）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染所引起繁殖母豬出現(xiàn)嚴(yán)重的繁殖障礙（表現(xiàn)為后備母豬受胎率低、妊娠母豬流產(chǎn)或產(chǎn)死胎、木乃伊胎）和仔豬呼吸障礙及高熱等臨床癥狀的一種高發(fā)的傳染病，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成很大的經(jīng)濟損失[1-2]。2006年，我國江西地區(qū)暴發(fā)高致病性藍(lán)耳?。℉P-PRRS），其后在我國各地豬場廣泛暴發(fā)，與古典型毒株相比，感染高致病性毒株的豬群所表現(xiàn)的臨床癥狀更為嚴(yán)重，發(fā)病率和死亡率也更高，我國眾多養(yǎng)豬人士談“藍(lán)耳”色變[3]。其后我國2014年河南等諸多地區(qū)又暴發(fā)類NADC30藍(lán)耳病毒株，使得在我國流行的PRRSV毒株類型復(fù)雜，防控形勢更加嚴(yán)峻[4]。

本次研究于2017年6月至2018年9月，采用RT-PCR技術(shù)對懷化市部分地區(qū)豬場送檢的326份病料檢測PRRSV病原，以了解PRRSV在該地區(qū)的流行情況，為懷化市PRRS的防控提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 病料樣品來源

本次研究所收集的326份疑似PRRSV感染的病料均來自于懷化市各地區(qū)，在這些病料樣品中有161份樣品來源豬群臨床癥狀表現(xiàn)為妊娠母豬流產(chǎn)、死胎或仔豬呼吸困難等，剩余樣品來源豬群未表現(xiàn)以上臨床癥狀。所有樣品包括淋巴結(jié)、扁桃體、肺臟、肝臟和腎臟等，由各養(yǎng)殖場（戶）通過臨床解剖后，低溫保存送至病原診斷實驗室，分別對送檢樣品進行編號記錄相關(guān)信息（采樣時間、地點和采樣部分等）后，保存于-80℃，待檢。

1.2 主要試劑與設(shè)備

DNA/RNA extraction kit購自于OMEGA公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒為天根生物公司產(chǎn)品；2×Taq PCR mix、DL 2 000 Marker等購自于TaKaRa公司；不同規(guī)格移液器購自于大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司；不同規(guī)格的槍頭、離心管等購自于華大生物科技有限公司。PCR儀購自于美國Biorad公司；高速低溫離心機購自于長沙麥佳森儀器設(shè)備有限公司；電泳儀和相應(yīng)電泳槽購自于北京市六一儀器廠等。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank公布的PRRSV不同基因型分離株的基因組序列，我們分別設(shè)計了針對經(jīng)典PRRSV毒株和高致病性PRRSV毒株的診斷引物，所針對的基因片段分別為N基因和NSP2基因，引物名稱和序列分別為PRRSV-N-F：5'-TCATCGCCCAACAAA CCAG-3'，PRRSV-N-R：5'-GCGTCGGCAAACTAAA CTCC-3'，擴增片段大小約為 400 bp；HP-PRRSV-N SP2-F：5'-CCTCCGTGGTGCAACAAATCTTG-3'，HPPRRSV-NSP2-R：5'-CGATGATAGCTTGAGCTCAGT AT-3'，擴增片段大小約為1 100 bp。引物送由長沙擎科生物科技有限公司合成。

1.4 病料基因組提取與cDNA合成

將組織病料勻漿，低溫高速離心后，按DNA/RNA提取試劑盒說明書對組織上清液中核酸進行提取，以核酸為模板，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA樣品，保存于-80℃，待檢。

1.5 PRRSV病原檢測

以cDNA為模板，采用RT-PCR法檢測其中是否存在 PRRSV 核酸，體系（25 μL）：2×PCR easy taq mix：12.5 μL；上游引物：1 μL；下游引物：1 μL；cDNA樣品：1 μL；無 RNA 酶水：9.5 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 30 s；56 ℃退火 30 s；72 ℃延伸45 s；共35個循環(huán)，其后72℃延伸7 min，每次PCR反應(yīng)均設(shè)置陽性對照和陰性對照，模板分別為PRRSV基因組和無RNA酶水。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳，其中凝膠瓊脂的濃度為1%，電泳條件為120 V 25 min，電泳結(jié)束后在凝膠系統(tǒng)成像儀下觀察結(jié)果。

2 調(diào)查結(jié)果

2.1 懷化市不同地區(qū)送檢樣品PRRSV RT-PCR檢測結(jié)果

本次研究收集的324份送檢樣品來自于懷化市不同地區(qū)的83個豬場，共6個縣市地區(qū)，分別為沅陵縣（18個）、溆浦縣（8個）、會同縣（10個）、洪江市（11個）、芷江縣（15個）和麻陽縣（21個），不同被調(diào)查縣市送檢豬場PRRSV場陽性率存在一定差異，為54.55%～80.00%，其中以芷江縣最高（80.00%），而洪江市最低，為54.55%。在對不同地區(qū)送檢樣品調(diào)查結(jié)果進行統(tǒng)計后，發(fā)現(xiàn)不同縣市送檢樣品PRRSV檢出率為27.78%～68.75%，平均檢出率為42.94%（140/326），其中以麻陽縣最高，為68.75%，而洪江市最低（27.78%）。詳見表1。

表1 懷化市不同地區(qū)送檢樣品PRRSV RT-PCR檢測結(jié)果

2.2 不同臨床表現(xiàn)豬群PRRSV RT-PCR檢測結(jié)果

本次收集的326份樣品來源病豬的臨床癥狀有所不同，其中主要分為妊娠母豬流產(chǎn)、死胎，保育豬或肥育豬呼吸困難、高熱等，樣品數(shù)量分別為68份和93份，表現(xiàn)其它臨床癥狀樣品數(shù)量為165份。RT-PCR檢測結(jié)果如表2所示，PRRSV是導(dǎo)致妊娠母豬流產(chǎn)、死胎和豬群出現(xiàn)高熱和呼吸困難等癥狀的主要病原之一，其檢出率分別為54.51%（37/68）和52.69%（49/93），而表現(xiàn)其它臨床癥狀發(fā)病豬群的PRRSV檢出率為37.72%（54/165）。

表2 不同臨床表現(xiàn)豬群PRRSV RT-PCR檢測結(jié)果

2.3 PRRSV不同毒株感染情況調(diào)查結(jié)果

應(yīng)用兩種檢測不同型的PRRSV毒株引物對樣品進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)140份陽性樣品中單一感染經(jīng)典型PRRSV的病料樣品為48份，陽性率為14.72%（48/326），陽性樣品中所占比例為34.39%（48/140），單一檢測為高致病性PRRSV的病料樣品有69份，陽性率為21.17%（69/326），陽性樣品中所占比例為49.29%（69/140），而其它屬于混合感染高致病性PRRSV和經(jīng)典型PRRSV，共23份，檢出率為7.01%（23/326），陽性樣品中所占比例為16.43%（23/140）。

3 分析與討論

自高致病性PRRSV在我國暴發(fā)與流行以來，我國政府與相關(guān)機構(gòu)花費大量的精力用于監(jiān)測國內(nèi)PRRSV分子流行情況與遺傳變異情況，為相應(yīng)的疫苗開發(fā)與疫病防控提供參考。本次研究于2017年6月至2018年9月對懷化市部分地區(qū)豬場送檢的326份疑似病料樣品進行PRRSV病原檢測，RTPCR診斷結(jié)果表明該地區(qū)送檢病料中PRRSV檢出率為42.94%（140/326），之前懷化市疾控中心曾對屠宰場健康豬群扁桃體樣品進行病原檢測，其中PRRSV和HP-PRRSV的檢出率分別為13.61%和3.89%[5]，說明PRRSV是引起懷化市豬群發(fā)病的主要病原之一，且流行情況較為嚴(yán)重。

筆者及團隊對此次研究調(diào)查的樣品進行統(tǒng)計與分類，發(fā)現(xiàn)懷化市不同地區(qū)送檢樣品中PRRSV檢出率存在差異，為27.78%～68.75%，平均檢出率為 42.94%（140/326），其中以麻陽縣最高，為68.75%，而洪江市最低（27.78%），且被調(diào)查的83個豬場中場陽性率為65.06%（54/83）。誠然，PRRSV廣泛流行于懷化市不同地區(qū)豬場，對該市生豬養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展威脅巨大。通過對樣品臨床癥狀表現(xiàn)進行分類和統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)繁殖母豬表現(xiàn)為流產(chǎn)、死胎等臨床癥狀的樣品中PRRSV檢出率為54.51%（37/68），而表現(xiàn)高熱、呼吸困難的豬群樣品檢出率為52.69%（49/93）。PRRSV是導(dǎo)致豬群繁殖與呼吸障礙的主要病原之一，但被調(diào)查豬群也存在感染其它病原的可能，如偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬瘟病毒等，對病料的混合感染其它病原的狀況還需要進一步調(diào)查與統(tǒng)計。此外，140份PRRSV陽性樣品中單一感染經(jīng)典型毒株和高致病性毒株的樣品數(shù)量分別為48和69份，混合感染兩種類型毒株樣品數(shù)量為23份，在陽性樣品中所占比例分別為34.39%（48/140）、49.29%（69/140）和 16.43%（23/140），說明該地區(qū)的確存在兩種不同類型PRRSV毒株流行的情況，其中部分豬場甚至存在兩種類型毒株流行的情況，提示在懷化市地區(qū)流行的PRRSV毒株類型較為復(fù)雜，應(yīng)加強分子流行病學(xué)監(jiān)測，為疫病的防控與凈化提供數(shù)據(jù)支持。