王 歡，王麗娜，顧 偉

海軍作為保衛(wèi)我國海洋權(quán)益的武裝力量是當(dāng)前我軍發(fā)展的重中之重，渡海作戰(zhàn)是海軍軍事訓(xùn)練的重要內(nèi)容，訓(xùn)練中意外落水，長時間浸泡海水后發(fā)生低體溫癥的復(fù)溫救治一直是亟待解決的問題。 在新時期提高海上救治能力無疑是衛(wèi)勤保障工作的重點，而海上遇險人員中約2/3 遇難者是由于冷海水浸泡導(dǎo)致的體溫過低所致［1］。

體溫過低可引起嚴(yán)重的心血管功能紊亂及肺水腫等情況，其特點是體溫下降、血壓下降、心率減慢、肺泡出血、水腫、炎性細胞浸潤、肺泡結(jié)構(gòu)破壞、存活率下降等。 若落水官兵得不到及時的復(fù)溫及抗休克治療，死亡率可達30% ～80%。 因此，復(fù)溫是海戰(zhàn)落水導(dǎo)致體溫過低傷員救治的重要環(huán)節(jié)。 復(fù)溫的方法分2 種，主動復(fù)溫和被動復(fù)溫，其中被動復(fù)溫如提高周圍環(huán)境溫度和主動復(fù)溫中的加熱毯法、應(yīng)用復(fù)溫裝置、熱水浴等體表復(fù)溫方法較適用于輕中度低體溫癥。 然而對于重度體溫過低癥傷員，傳統(tǒng)的心血管活性藥和除顫技術(shù)使用受限是復(fù)溫救治失敗的主要原因［2-3］。 針對重度體溫過低癥的抗休克治療，目前尚缺乏有效的藥物及技術(shù)方案。 因此發(fā)現(xiàn)一種對低體溫癥患者敏感的、能有效提高心肌興奮性，改善肺組織損傷情況的抗休克藥物對于海戰(zhàn)落水傷員的成功復(fù)溫救治具有重要的意義。

體溫過低癥的臨床表現(xiàn)與祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的“脫證”、“厥證”相一致，傳統(tǒng)中醫(yī)中藥對于此類疾病的救治歷史悠久，人參、附子等回陽救逆的傳統(tǒng)中藥已經(jīng)在臨床中廣泛應(yīng)用［4］。 參附注射液源于古方，具有回陽救逆、益氣固脫功效，藥理實驗證實其主要有效成分為人參皂甙和烏頭類生物堿。 臨床研究表明參附注射液有改善心臟功能，增強心肌細胞對缺血、缺氧的耐受性，強心、升壓、穩(wěn)壓，緩解支氣管平滑肌痙攣，保護損傷肺組織細胞，調(diào)節(jié)機體免疫功能等作用［5-8］。 臨床廣泛應(yīng)用于休克、心衰、心律失常等疾病，也有用于休克后低體溫的復(fù)溫治療［9］。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與器材 健康成年雄性ICR 小鼠50只，體質(zhì)量為18 ～22 g，購于浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。 參附注射液（雅安三九、國藥準(zhǔn)字Z51020664、10 ml ×5）、動物體溫儀（型號FT3400，南京卡爾文生物科技有限公司生產(chǎn)）、自制懸吊式小鼠水浴固定器（高10 cm，直徑2. 5 cm，專利已受理）、泡沫水浴箱［用碎冰將水溫控制在（15 ±1）℃］、水溫溫度計1 支，計時器1 個。

1.2 動物分組與實驗方法 取上述ICR 小鼠50只， 按照隨機數(shù)字編號分為3 組， 即空白對照組（BLANK，n=10）、 生理鹽水組（NS，n =20）、參附注射液組（SF，n =20）。 BLANK 組不做處理；SF 組給予參附注射液15 ml/kg，腹腔注射，每日1 次，連續(xù)給藥3 d，第3 天于水浴浸泡前30 min 給藥；NS 組小鼠同樣方法給予相同劑量的生理鹽水。 水浴浸泡前小鼠禁食12 h，自由飲水，室溫為（24 ±1） ℃，將2 組小鼠分別放入自制懸吊式小鼠水浴固定器中，上端由鐵絲固定懸掛，直立放置，鼠籠高10 cm，直徑2.5 cm，浸泡在15 ℃的水中，水位達鎖骨水平，頭露在水面以上。 水浴浸泡6 h 后取出小鼠，擦干身體放于鼠籠中被動復(fù)溫，待肛溫達到水浴前肛溫水平時視為復(fù)溫成功。 實驗過程中，NS 組和SF 組存活的小鼠，均隨機分為2 組，分別于被動復(fù)溫（水浴后取出約6 h）后6 h 和12 h 麻醉，眼眶取血而后處死。

1.3 觀測指標(biāo) 實驗過程中，密切觀察實驗小鼠的生命體征，記錄各組小鼠的死亡時間，計算各組的生存率，繪制小鼠生存曲線；水浴前后分別測量各組小鼠的肛溫，如果實驗過程中小鼠死亡，則立即取出并測量肛溫；實驗結(jié)束后，分別于復(fù)溫后6 h 和12 h 用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉各組存活小鼠，眼眶取血，3 000 r/min 離心10 min，離心半徑10 cm，分離血清檢測丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）水平；取血后解剖小鼠，取肺臟組織用生理鹽水洗凈，置于10%福爾馬林溶液中固定，脫水，石蠟包埋，制片，HE 染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織的病理變化。 肺損傷評分:按照Smith 評分體系［10］，依據(jù)肺水腫、肺泡及間質(zhì)炎癥細胞浸潤、肺泡及間質(zhì)出血、肺不張和透明膜的形成等5 項指標(biāo)分別進行肺損傷嚴(yán)重程度評分。 肺血管、肺泡、間質(zhì)及支氣管均正常，為0 分；病變范圍小于整個視野面積的25%為1 分；病變范圍為整個視野面積的25% ～50%為2 分；病變范圍為整個視野面積的50% ～75%為3 分；病變范圍大于整個視野面積的75%為4 分；總的肺部損傷評分為上述各項之和。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示， 多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。 P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的生存率 NS 組和SF 組小鼠水浴過程中均出現(xiàn)動物死亡。 NS 組小鼠發(fā)生死亡時間較SF組早，15 ℃水浴浸泡6 h 后，NS 組和SF 組的生存率分別是50%和75%（P ＜0.05），說明參附注射液明顯提高低溫水浴小鼠的生存率。 見圖1。

注:BLANK 為空白對照組，NS 為生理鹽水組，SF 為參附注射液組

2.2 小鼠水浴前后肛溫的比較 NS 組和SF 組小鼠水浴后肛溫與水浴前比較，均明顯降低（P ＜0.05）。 水浴后SF 組肛溫高于NS 組（P ＜0.05），說明與NS 組相比，參附注射液能夠改善水浴浸泡對小鼠肛溫的降低程度。 見表1。

表1 水浴前后各組小鼠肛溫的變化比較

表1 水浴前后各組小鼠肛溫的變化比較

注:與BLANK 組比aP ＜0. 05；與NS 組同期相比bP ＜0. 05。BLANK 為空白對照組，NS 為生理鹽水組，SF 為參附注射液組

組別 鼠數(shù) 體溫（℃）BLANK 組 10 38.64 ±0.46 NS 組水浴前 20 38.68 ±0.50 SF 組水浴前 20 38.74 ±0.49 NS 組水浴后 20 18.89 ±1.32a SF 組水浴后 20 19.87 ±0.80ab

2.3 小鼠血液生化指標(biāo)的變化 復(fù)溫6 h 后，NS 組和SF 組血清ALT 水平均明顯高于空白對照組（P ＜0.05）。復(fù)溫后12 h，2 組血清ALT 水平均下降，與BLANK 組比較，NS 組高于BLANK 組（P ＜0.05），SF 組略高于BLANK 組（P ＞0.05）；與NS 組比較，SF 組ALT 水平降低更明顯（P ＜0.05），說明SF 組小鼠血液ALT 水平恢復(fù)更快。 復(fù)溫后6 h 和12 h，NS 組和SF 組小鼠血液AST 水平均高于BLANK 組（P ＜0.05）；SF 組AST 水平在復(fù)溫后6 h和12 h 均低于NS 組（P ＜0.05）；復(fù)溫后12 h，SF 組AST 水平略高于BLANK 組（P ＞0.05）。 說明SF 組AST 水平恢復(fù)更快。 復(fù)溫后6 h 和12 h，NS 組和SF組血液LDH 水平均顯著高于BLANK 組（P ＜0.05），SF 組血液LDH 水平均低于NS 組（P ＜0.05），說明SF 組血液LDH 水平恢復(fù)情況較NS 組快。 綜上，在復(fù)溫后6 h 和12 h，小鼠血液生化指標(biāo)ALT、AST、LDH的恢復(fù)情況，SF 組均優(yōu)于NS 組。 見表2。

2.4 肺組織病理變化及病理評分 BLANK 組小鼠肺組織支氣管上皮結(jié)構(gòu)完整，上皮細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常、排列緊密。 水浴浸泡后小鼠肺臟組織均可見肺泡壁增厚，并有淋巴細胞與中性粒細胞浸潤，局部血管周圍可見水腫，靜脈與毛細血管淤血擴張，局部可見出血，肺泡結(jié)構(gòu)破壞。 與NS 組相比，SF 組小鼠肺泡出血、水腫較輕，炎性細胞浸潤較少，肺泡結(jié)構(gòu)較少破壞。 復(fù)溫后12 h，2 組小鼠肺泡組織炎性細胞浸潤和出血均減少，肺組織損傷逐漸恢復(fù)，其中SF組基本恢復(fù)至正常狀態(tài)，而NS 組尚未恢復(fù)正常。 見圖2。 與BLANK 組相比，NS 組和SF 組肺組織病理評分均明顯增加（P ＜0.05）。 復(fù)溫后6 h 和12 h，SF組小鼠肺病理評分均顯著低于相應(yīng)時間點NS 組（P ＜0.05）。 說明參附注射液較生理鹽水能夠顯著改善低水浴浸泡引起的小鼠肺組織損傷情況。 見表3。

表2 各組小鼠血液生化指標(biāo)的的變化

表2 各組小鼠血液生化指標(biāo)的的變化

注:與BLANK 組比aP ＜0.05；與NS 組同期相比bP ＜0.05。 BLANK 為空白對照組，NS為生理鹽水組，SF 為參附注射液組；ALT 為丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶，AST 為天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，LDH為乳酸脫氫酶

組別 鼠數(shù) ALT（U/L） AST（U/L） LDH（U/L）BLANK 組 10 17.55±2.30 33.91±4.06 196.98±11.68 NS 組復(fù)溫6 h 5 77.60±11.58a 139.87±45.92a 830.72±218.00a SF 組復(fù)溫6 h 8 55.33±14.21ab 91.99±30.91ab 653.14±133.10ab NS 組復(fù)溫12 h 5 39.28±4.34a 83.13±8.32a 613.03±104.08a SF 組復(fù)溫12 h 7 26.09±6.75b 53.54±7.66b 381.70±78.42ab

表3 水浴前后各組小鼠肺病理評分比較（分

表3 水浴前后各組小鼠肺病理評分比較（分

注:與BLANK 組比aP ＜0. 05；與NS 組同期相比bP ＜0.05。BLANK 為空白對照組，NS 為生理鹽水組，SF 為參附注射液組

組別 鼠數(shù) 肺病理評分BLANK 組 10 2.40 ±0.70 NS 組復(fù)溫6 h 5 14.40 ±1.4a SF 組復(fù)溫6 h 8 11.38 ±1.06ab NS 組復(fù)溫12 h 5 10.00 ±0.70a SF 組復(fù)溫12 h 7 7.14 ±0.69ab

圖2 各組小鼠肺臟組織病理形態(tài)學(xué)（A1 ～E1：HE 染色×200；A2 ～E2：HE 染色 ×400）

3 討論

回陽救逆是運用具有溫?zé)嶙饔玫乃幬?，針對陰寒?nèi)盛危重癥的治法，屬于中醫(yī)溫法之一，適用于陽氣極度衰疲，寒邪深入少陰的危重證候。 參附注射液源于古方參附湯，方中人參甘溫大補元氣；附子大辛大熱，溫壯元陽。 二藥相配，共奏回陽周脫之功?！秳h補名醫(yī)方論》云:“補后天之氣，無如人參；補先天之氣，無如附子，此參附湯之所由立也……二藥相須，用之得當(dāng)，則能瞬息化氣于烏有之鄉(xiāng)，頃刻生陽于命門之內(nèi)，方之最神捷者也”。 現(xiàn)代臨床上，其主要用于治療急性心力衰竭、心源性猝死以及休克等疾病。

ALT 和AST 是一組催化氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶類，被用于肝臟疾病檢查。 ALT 廣泛存在于機體組織細胞內(nèi)，但以肝臟細胞含量最多；在肝細胞中ALT 則主要存在于肝細胞質(zhì)中，少量存在于線粒體內(nèi)［11］。LDH 是一種糖酵解酶，廣泛存在于人體組織內(nèi)，以心肌、骨骼肌和腎臟含量最豐富，其次為肝、脾、肺和腫瘤組織，紅細胞內(nèi)含量極豐富。 當(dāng)心肌及肺組織等損傷時，LDH 可釋放入血，使血中LDH 活性升高。低溫水浴環(huán)境中，小鼠周身血管收縮從而使全身有效血循環(huán)量減少，各臟器或多或少出現(xiàn)缺血損傷情況，尤其是肝臟組織和肺組織更明顯，有研究表明體溫過低動物被動復(fù)溫過程中可能通過激活氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)增加肺臟損傷［12］。

本研究參附注射液為臨床上常規(guī)用量，為更能體現(xiàn)藥物作用，提前3 d 用藥。 生存率及生存曲線結(jié)果顯示，參附注射液能夠顯著提高低溫水浴浸泡小鼠的生存率，可能與參附注射液發(fā)揮回陽救逆的作用有關(guān)，可提升小鼠對低溫的耐受，從而使其存活。 水浴后肛溫的變化結(jié)果說明參附注射液能夠保護低溫水浴浸泡小鼠的基礎(chǔ)體溫，可能與增加機體自身產(chǎn)熱有關(guān)，具體機制有待進一步研究。 ALT、AST、LDH 等指標(biāo)顯示，參附注射液能夠顯著提升小鼠生化指標(biāo)的恢復(fù)速度。 有研究表明，參附注射液能夠減少LDH 的釋放，發(fā)揮心臟保護作用［13］。 可能是在低溫狀態(tài)下，參附注射液發(fā)揮了對肝功能缺血性損傷的保護作用有關(guān)［14］。 肺臟病理組織形態(tài)學(xué)及病理評分結(jié)果說明，低溫水浴浸泡后的小鼠，無論是肺組織的損傷程度，還是肺組織損傷后的恢復(fù)狀態(tài)，SF 組均明顯比NS 組有優(yōu)勢，可能是參附注射液通過自身溫陽益氣的作用提高機體免疫力，拮抗了低溫浸泡時的陰寒凝滯，從而減輕肺組織損傷。有研究表明，參附方可以降低亞低溫治療顱腦損傷大鼠時并發(fā)肺水腫的發(fā)生率和嚴(yán)重程度［15］。 臨床研究發(fā)現(xiàn)，參附注射液能夠明顯改善慢性心力衰竭患者肺水腫的臨床療效［16］。

綜上所述，參附注射液源于古方，在現(xiàn)代領(lǐng)域多個疾病中廣泛應(yīng)用。 本課題探究參附注射液對低溫水浴浸泡小鼠影響，結(jié)果顯示其能夠顯著提高低溫水浴浸泡小鼠的生存率，改善小鼠血液生化指標(biāo)情況，減輕小鼠肺組織損傷程度。 進一步對其具體作用機制的研究，將有助于推進其在低體溫癥領(lǐng)域的臨床應(yīng)用，從而更好地提高我國海軍重要作戰(zhàn)能力。