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        一例因基因突變致LIG4綜合征病例的臨床特點(diǎn)及分析

        2020-06-09 09:27:48張瀟瀟顧浩翔吳蓓蓉
        關(guān)鍵詞:基因突變本例畸形

        張瀟瀟,陸 敏,顧浩翔,吳蓓蓉

        (上海市兒童醫(yī)院 上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 小兒呼吸內(nèi)科, 上海 200040)

        DNA連接酶Ⅳ(DNA ligase Ⅳ,LIG4)位于染色體13q33-34上,編碼911個(gè)氨基酸的多肽[1]。 DNA連接酶Ⅳ突變導(dǎo)致LIG4綜合征,這是一種極其罕見的常染色體隱性遺傳免疫缺陷病,是由于DNA非同源末端連接(non-homologous DNA end joining,NHEJ)修復(fù)缺陷導(dǎo)致。其臨床特征為小頭畸形, 特殊面容,發(fā)育遲緩,血細(xì)胞數(shù)量減少和不同程度的免疫缺陷[2]。本文對(duì)一例LIG4綜合征患兒的臨床特點(diǎn)及基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行總結(jié),并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行分析。

        1 材料與方法

        1.1 對(duì)象

        上海市兒童醫(yī)院診治LIG4綜合征一例:患兒,男,1歲8個(gè)月,G1P1,足月順產(chǎn),出生史無異常?;純焊改阜墙H結(jié)婚,否認(rèn)家族性、遺傳性病史。

        本研究獲得了上海市兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào):2016R025-E01),并得到了患兒家屬的知情同意。

        1.2 方法

        二代高通量基因測(cè)序:采集患兒(及父母)靜脈血2 mL,置乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中,用QIAamp DNA Blood Mini Kit DNA提取試劑盒提取基因組DNA。用NANODrop 2000 (Thermo公司)及1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA質(zhì)量和濃度進(jìn)行檢測(cè)。用超聲儀將DNA隨機(jī)打斷成300~400 bp片段,純化產(chǎn)物經(jīng)末端修復(fù)后進(jìn)行接頭連接、PCR擴(kuò)增,構(gòu)建測(cè)序文庫,使用HiseqX10(Illumia公司)平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)院/分子病理學(xué)協(xié)會(huì)(ACMG/AMP)的變異分類指南對(duì)統(tǒng)計(jì)出的變異結(jié)果進(jìn)行致病性分類。對(duì)判斷為致病、可能致病及臨床意義未明的患者,采用相同變異位點(diǎn)的Sanger測(cè)序法對(duì)患者及父母進(jìn)行檢測(cè)。

        2 結(jié)果

        2.1 本例患兒臨床特點(diǎn)

        患兒,男,1歲8個(gè)月,因“咳嗽1月余,發(fā)熱4 d”入住上海市兒童醫(yī)院。既往有反復(fù)呼吸道感染、慢性腹瀉病史,患兒及其家長從未去過南美洲。查體:T 36.7 ℃,P 120次/min,R 35次/min,體質(zhì)量9.5 kg,身長84 cm,頭圍41 cm,。神志清,呼吸平穩(wěn),反應(yīng)可,小頭畸形,三角形臉,眼睛輕微下斜,鼻翼較寬,全身皮膚黏膜未見皮疹及出血點(diǎn),淺表淋巴結(jié)未及明顯腫大,吸凹(-),無鼻翼扇動(dòng)。瞼結(jié)膜無充血,頸軟,咽部充血,口腔有大量白絮狀物,扁桃體I度腫大,胸廓對(duì)稱,無畸形,兩側(cè)呼吸運(yùn)動(dòng)對(duì)稱,肋間隙未見明顯增寬。雙肺叩診呈清音,雙肺呼吸音粗,可聞及痰鳴音。心音有力,律齊,未及雜音,腹軟,不脹,無壓痛,無反跳痛,四肢活動(dòng)可,肛門生殖器無異常,神經(jīng)系統(tǒng)查體未見異常。

        實(shí)驗(yàn)室檢查:血常規(guī)示W(wǎng)BC 3.53×109/L,RBC 4.08×1012/L,Hb 112 g/L,PLT 353×109/L,N 0.56,L 0.20,CRP 30 mg/L,網(wǎng)織紅細(xì)胞1.36%。肝腎功能電解質(zhì)正常。病原學(xué):呼吸道合胞病毒(痰液),耐藥支原體感染(肺泡灌洗液DNA)、流感嗜血桿菌+白色念珠菌(肺泡灌洗液),EB病毒(DNA),白色念珠菌(糞便)。細(xì)胞免疫、體液免疫功能缺陷(表1)。

        其他檢查:支氣管黏膜活檢:電鏡下大量脫落黏膜柱狀上皮細(xì)胞,表面微絨毛豐富,部分上皮細(xì)胞溶酶體增多。視野中所有細(xì)胞均未見纖毛結(jié)構(gòu)。超微結(jié)構(gòu)觀察提示:黏膜上皮細(xì)胞變性、脫落,纖毛缺失可疑 (圖1)。

        2.2 基因檢測(cè)結(jié)果

        基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)本例患兒的LIG4基因第833位堿基存在純合性改變:c.833G>T(p.R278L),分別遺傳自患兒父母(圖2)。

        表1 本例患兒免疫功能檢查結(jié)果Table 1 The child’s immune function test results

        A.a large number of mucosal columnar epithelial cells were shed, and the surface was rich in microvilli, no ciliary structure was seen in all cells in the visual field; B.mucosal epithelial cells degenerated, shed, and cilia were deleted

        圖1 患兒支氣管黏膜活檢電鏡結(jié)果
        Fig 1 Electron micrograph of bronchial mucosal biopsy of the child

        the arrow showed the mutation site圖2 患兒及其父母的LIG4基因測(cè)序結(jié)果Fig 2 Sequencing results of LIG4 gene of the child and his parents

        3 討論

        DNA雙鏈斷裂(DNA double strand break,DSB)是最常見的DNA損傷形式,這些病變可由正常的內(nèi)源性過程誘導(dǎo),包括DNA復(fù)制、減數(shù)分裂和B(T)細(xì)胞發(fā)育期間的V(D)J重組[3],以及外源性的電離輻射(IR)、細(xì)胞毒性藥物。DNA修復(fù)缺陷可導(dǎo)致細(xì)胞死亡、基因突變和癌癥。DNA修復(fù)可通過非同源末端連接(NHEJ)或同源重組(homologous recombina-tion,HR)修復(fù)。NHEJ是主要的DSB修復(fù)途徑,其中兩個(gè)末端在限制性內(nèi)切酶處理后重新連接。至少6種蛋白質(zhì)組分在NHEJ中起作用,包括:Ku70、Ku80、DNA-PKcs(蛋白激酶DNA激活催化多肽,PRKDC)、DNA連接酶Ⅳ、XRCC4(X線修復(fù)交叉互補(bǔ)蛋白4)和Artemis[4],其中DNA連接酶Ⅳ對(duì)于進(jìn)行最終的“末端連接”必不可少。DSB修復(fù)缺陷可導(dǎo)致癌癥易感性、免疫功能障礙、放射敏感性、發(fā)育遲緩和神經(jīng)變性。NHEJ介導(dǎo)的DSB修復(fù)缺陷占人類遺傳性聯(lián)合免疫缺陷病的15%。通過PubMed、Springer Link和Elsevier數(shù)據(jù)庫、萬方數(shù)據(jù)庫、CNKI數(shù)據(jù)庫檢索出LIG4綜合征病例42例(包括本研究一例)。LIG4綜合征臨床特征主要有:小頭畸形42例(100%),不同程度免疫缺陷42例(100%),特殊面容21例(50%),血細(xì)胞下降17例(40%),發(fā)育遲緩16例(38%),放射敏感性11例(26%),腫瘤9例(21%)。其中4例造血干細(xì)胞移植成功,其余均死于感染、移植后排異反應(yīng)等。目前共發(fā)現(xiàn)25種基因突變類型(表2),其中c.833G>T(p.R278L)是中國LIG4綜合征患者的突變熱點(diǎn)。預(yù)測(cè)R278L可能通過改變氫鍵來影響DNA連接酶Ⅳ的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[5]。本例患者基因檢測(cè)結(jié)果即為c.833G >T純合子突變。

        免疫缺陷是LIG4綜合征患者主要的臨床表現(xiàn)之一。B細(xì)胞和T細(xì)胞分化的早期階段產(chǎn)生抗原特異性B細(xì)胞和T細(xì)胞受體,V(D)J重組缺陷導(dǎo)致免疫缺陷。V(D)J重組過程中產(chǎn)生發(fā)夾密封的編碼末端和鈍化的磷酸化信號(hào)末端。這些DNA末端被NHEJ途徑的蛋白識(shí)別和分析,分別形成編碼連接和重組信號(hào)。KU70/KU80異二聚體直接結(jié)合DNA末端,允許激活DNA-PK催化亞基(DNA-PKcs)和磷酸化Artemis, 在NHEJ的最后階段, DNA連接酶Ⅳ(LIG4)/XRCC4復(fù)合物介導(dǎo)DNA末端的連接[12]。受損的V(D)J重組,T和B淋巴細(xì)胞生成中的缺陷導(dǎo)致B和T輔助性淋巴細(xì)胞減少癥。不同程度的免疫缺陷可能是由于有些類型的突變產(chǎn)生少量正常的活性蛋白與低于檢測(cè)下限的LIG4蛋白[13]。低水平的LIG4蛋白足以使細(xì)胞存活,但V(D)J重組顯然需要更高的LIG4蛋白水平。本例患兒存在體液免疫及細(xì)胞免疫缺陷,導(dǎo)致反復(fù)的呼吸道感染,長期的抗生素治療破壞了內(nèi)環(huán)境的紊亂,繼發(fā)真菌感染,胃腸功能紊亂。

        表2 文獻(xiàn)報(bào)道的LIG4基因突變Table 2 Mutations of LIG4 gene from literatures

        Murray 等[8]報(bào)告了11例小頭畸形患者的LIG4基因突變,所有患者父母都是正常表型的雜合子攜帶者,患者表現(xiàn)出嚴(yán)重的產(chǎn)前和產(chǎn)后發(fā)育遲緩。這項(xiàng)研究擴(kuò)展了與LIG4突變相關(guān)的表型譜即小頭畸形、發(fā)育遲緩是LIG4綜合征的常見表現(xiàn)。Rucci等[14]研究發(fā)現(xiàn),在LIG4缺陷小鼠中,大量神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,是導(dǎo)致小頭畸形、發(fā)育遲緩的主要原因。很多LIG4綜合征患者在兒童早期有相似的面容,常見特征有毛發(fā)稀疏,贅肉褶皺,寬鼻竇,鼻尖寬,下巴突出,也稱作“鳥樣面容”[8]。LIG4綜合征患者存在血細(xì)胞下降,其中血小板受影響最嚴(yán)重,其次是白細(xì)胞,血紅蛋白僅輕度降低。骨髓穿刺沒有發(fā)現(xiàn)形態(tài)異常的幼稚骨髓細(xì)胞,隨著年齡的增長需要輸注血制品的次數(shù)增加,逐漸進(jìn)展為骨髓衰竭[15],骨髓衰竭的原因是由于DSB在多能造血干細(xì)胞發(fā)育過程中逐漸積累導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16]。一例LIG4基因突變的急性淋巴細(xì)胞白血病患者,因預(yù)防性頭顱放射治療致頭皮脫落和雙側(cè)乳突放射性潰瘍脫落,并死于放射性腦病[17]。從LIG4綜合征患者體內(nèi)分離出的人成纖維細(xì)胞放射敏感性增加[18]。此外,部分LIG4綜合征患者出現(xiàn)惡性腫瘤,Bacon等[19]報(bào)道了 2例患者有EB病毒相關(guān)淋巴瘤,還有惡性鱗狀細(xì)胞癌的報(bào)道[18]。

        值得注意的一點(diǎn)是,LIG4基因缺陷的臨床和免疫表現(xiàn)是可變的。已經(jīng)報(bào)道了一些患者中有自發(fā)性體細(xì)胞修復(fù)的情況,這種現(xiàn)象稱為“天然基因療法”[20],可使患者存活時(shí)間延長。推測(cè)有可能是重組介導(dǎo)的基因內(nèi)交叉引起體細(xì)胞的修復(fù)。自發(fā)性逆轉(zhuǎn)患者的疾病進(jìn)程有所改善,如生存期延長和癥狀減輕,但這些改善不足以預(yù)防致命性并發(fā)癥,并且無法完全恢復(fù)細(xì)胞功能,遠(yuǎn)期臨床進(jìn)展和機(jī)制尚不清楚。因此需要更多的案例和研究來揭示這種罕見疾病的罕見情況。這種現(xiàn)象或許將來可以為基因治療提供思路。

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