周凡琦，馮文新，譚普文，馬艷妮，王 棟，余 佳*

(1.中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室， 北京 100005；2.河南地礦職業(yè)學院， 河南 鄭州 450000；3.南方醫(yī)科大學基礎學院 生物信息系， 廣東 廣州 510000)

人胚胎干細胞(human embryonic stem cells，hESCs)是研究早期胚胎發(fā)育的細胞模型。人受精卵在受精后5 d內(nèi)形成胚泡期胚胎，hESCs從胚泡期胚胎的內(nèi)細胞群中分離出來[1-2]，hESCs具有無限的復制潛力和多能性，能夠分化成人體內(nèi)任何體細胞類型[1]。這一特性使其有機會更新非功能性損傷組織，如帕金森病、脊髓灰質(zhì)炎等疾病，目前基于hESCs治療多種疾病的研究在臨床前階段已經(jīng)取得了十分不錯的成績[3-4]。

RNA定位在細胞發(fā)育、命運決定等方面具有重要作用，如酵母細胞在分裂時，ASH1 mRNA定位于子細胞芽尖，進行局部翻譯以調(diào)控其交配型的選擇，從而確保子細胞產(chǎn)生與母細胞不同的交配類型[5-6]。在果蠅胚胎中，Bicoid mRNA定位于胚胎前極，Oskar mRNA、Nanos mRNA定位在后極，這種定位模式有助于果蠅胚胎建立形態(tài)梯度，為發(fā)育中的胚胎形成合適的空間模式奠定基礎[7-9]等。這些mRNA及其蛋白產(chǎn)物在特定的亞細胞位置中發(fā)揮獨特的功能，對于細胞正常的生理活動具有極為重要的意義，同時越來越多的研究表明，mRNA特定亞細胞的定位現(xiàn)象十分普遍。對果蠅3 000多個轉(zhuǎn)錄本進行高分辨率免疫熒光分析，結(jié)果顯示約有71%的mRNA在早期胚胎中表現(xiàn)出顯著的亞細胞定位模式[10]。

目前RNA定位的研究主要集中研究果蠅胚胎或酵母細胞中RNA廣譜定位，揭示低等生命及哺乳動物細胞中某些特定RNA的定位及機制。哺乳動物細胞中對廣譜RNA定位及其機制的研究較少，暫無研究報道hESCs中RNA細胞核和細胞質(zhì)定位圖譜。本研究主要探討hESCs細胞核和細胞質(zhì)中RNA定位詳情及其特點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：hESCs為H1細胞系(中國醫(yī)學科學院血液學研究所贈送)。

1.1.2 主要試劑：matrigel(Corning公司)；DPBS(Gibco公司)；mTeSR1、ReLeSR和Accutase(STEMCELL公司)；核質(zhì)分離試劑盒(Thermo Fisher Scientificals公司：NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents)；Trizol、M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司)；SYBR GREEN mix(全式金生物科技有限公司)；抗HSP90抗體、抗Fibrillin抗體(Proteintech公司)；山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗(上海碧云天生物有限公司)；引物(天一輝遠測序公司)；建庫及測序(諾禾致源公司)。

1.2 方法

1.2.1 hESCs體外培養(yǎng)：將matrigel鋪至6孔板4 ℃過夜后接種H1克隆，使用mTeSR1培養(yǎng)。觀察密度，4～6 d傳代1次：DPBS清洗細胞，加入1 mL ReLeSR室溫靜置1 min后吸凈，將細胞放至37 ℃孵箱中6～8 min，加入3 mL mTeSR1將克隆重懸，傳代至6孔板中進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，DPBS、mTeSR1均需37 ℃預熱并且每天換液。

核質(zhì)的分離：使用Accutase將H1克隆消化成單細胞，吸取10% input后1 000 r/min離心得到細胞沉淀。使用核質(zhì)分離試劑盒，按照細胞體積加入適量預冷CER1重懸細胞，渦旋振蕩15 s，冰上孵育10 min；加入預冷CER2，渦旋振蕩5 s，冰上孵育1 min；渦旋振蕩5 s后21 000×g離心5 min，立即轉(zhuǎn)移上清至干凈的EP離心管中，此為細胞質(zhì)成分(cytoplasmic extraction，CE)；向剩余沉淀部分中加入適量預冷NER，渦旋振蕩15 s后冰上孵育40 min，且每10 min振蕩混勻15 s；21 000×g離心10 min，轉(zhuǎn)移上清至干凈的EP離心管管中，此為細胞核成分(soluble nuclear extraction，SNE)，SNE成分中不包含染色質(zhì)部分。

1.2.2 Western blot檢測細胞核與細胞質(zhì)標志蛋白的表達：提取input、CE、SNE蛋白后進行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜：HSP90、Fibrillin。TBST洗滌后加入二抗室溫孵育40 min，TBST洗膜后，用化學發(fā)光法顯影。

1.2.3 RT-qPCR檢測細胞核與細胞質(zhì)標志基因的表達：使用Trizol法提取RNA，采用M-MLV及Random primer法進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。RT-qPCR反應體系為：SYBR GREEN mix 5 μL，上下游引物(10 μmol/L)0.2 μL，cDNA 0.5 μL，去離子水4.1 μL；反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)；溶解曲線生成的反應程序為：95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。引物序列(表1)。

表1 RT-qPCR引物Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.2.4 建庫測序及生物信息學分析：將1 μg input/CE/SNE 總RNA去除rRNA并純化回收，而后進行鏈特異性建庫及測序；每組樣品均有兩個重復組；建庫及測序項目編號為P101SC18060916-01。

使用Trimmomatics(v0.36)對原始測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，利用Hisat2(v2.0.5)將原始數(shù)據(jù)比對至GENCODE(v28)參考基因組(mm10)后，利用featurecounts計算基因表達量并計算TPM值。進一步利用edgeR計算差異表達基因以及挖掘亞細胞組分特異基因，Metascape被用于功能富集分析(gene ontology，GO)，并使用pheatmap包繪制熱圖。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 hESCs核質(zhì)的分離

分離hESCs細胞核與細胞質(zhì)后檢測其標志基因可見細胞質(zhì)標志基因HSP90蛋白與β-actin RNA主要定位在細胞質(zhì)中(P<0.001)；細胞核標志基因Fribillin蛋白與U6主要定位于細胞核中(P<0.001)(圖1)。

2.2 hESCs中RNA核質(zhì)定位圖譜

hESCs核質(zhì)中總RNA的測序結(jié)果顯示，細胞質(zhì)中共定位30 232個RNA(TPM>1)，這些RNA類型豐富，共57種RNA，其中34%為蛋白編碼基因，17%為加工假基因，12%為基因間長鏈非編碼RNA(long intergenic non-coding RNA，lincRNA)(圖2A)。細胞核中共定位34 390個RNA(TPM>1)，共31種RNA，其中74%為蛋白編碼基因，7%為lincRNA，6%為反義RNA(圖2B)。

盡管很多RNA同時定位于胞質(zhì)與核質(zhì)，但也存在特異性定位于胞質(zhì)或核質(zhì)的RNA。hESCs細胞質(zhì)中特異定位的RNA多于細胞核(圖3C)，其中細胞質(zhì)中特異性定位2 952個RNA，約91.8%為mRNA，5.22%為加工假基因(圖3A)；細胞核中特異性定位RNA共634個，其中41.42%為mRNA，21.89%為lincRNA(圖3B)。這些基因的GO結(jié)果顯示(圖3D)，細胞質(zhì)中RNA功能豐富，參與細胞多種生理功能，如參與合成核糖核蛋白復合物、核苷酸代謝、氨基酸代謝、蛋白質(zhì)折疊、細胞分裂等，在細胞的正常生理活動中起重要作用。細胞核中特異定位的RNA較少，其富集的GO條目也較少，包含鉀離子反應、非鈉離子依賴的有機陰離子運輸、減數(shù)分裂重組等核內(nèi)生理活動相關(guān)調(diào)控?？梢奾ESCs細胞核和細胞質(zhì)中特異性定位的RNA功能特點與其定位特點緊密相關(guān)。

2.3 RT-qPCR驗證

根據(jù)上述分析結(jié)果各選擇10個細胞核和細胞質(zhì)特異定位的RNA進行驗證，驗證結(jié)果與測序結(jié)果一致(P<0.05)(圖4)，表明測序及分析結(jié)果真實可信(圖4A)。細胞質(zhì)中不僅特異性定位mRNA，如EEF2、HMGA1、LIN28A；此外還有一些非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)同樣定位于此，如EEF1A1P5、TUBBP1、RPS28P7等(圖4B)。除ncRNA外，細胞核中也有mRNA的定位，如自然殺傷細胞激活性受體(natural killer cell triggering receptor，NKTR)。

A.Western blot assay for markers(HSP90 and Fibrillin); B.RT-qPCR detection of marker genes(β-actin and U6);*P<0.001 compared with CE

A.TOP5 of RNA types in CE; B.TOP5 of RNA types in SNE圖2 hESCs細胞核和細胞質(zhì)中RNA類型Fig 2 RNA types of cytoplasm and nucleus of hESCs

A.TOP5 of RNA types of specifically localized in cytoplasm; B.TOP5 of RNA types of specifically localized in nucleus; C.heatmap of specific transcripts between subcellular fractions; Colors indicate the percentile of the relative expression level; D.gene ontology(GO) enrichment analysis of specific transcripts between subcellular fractions; biological duplicates

圖3 hESCs中RNA細胞核和細胞質(zhì)定位圖譜
Fig 3 The localization of RNA in cytoplasm and nucleus of hESCs(n=2)

3 討論

研究者既往工作表明在胚胎發(fā)育過程中，RNA的精準定位及其定位的變化均具有重要調(diào)控作用。如在果蠅發(fā)育的胚胎期，orb mRNA逐漸在胚胎后極的細胞核周圍形成獨特的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；同時，grp mRNA由彌散狀態(tài)逐漸定位至胚胎后極以發(fā)揮其功能[8,11]。hESCs具有分化為人體內(nèi)220多種細胞類型的潛力，它的分離與體外培養(yǎng)具有極其重要的基礎研究和臨床應用價值，明確hESCs的RNA定位圖譜對于探索hESCs全能性的維持及研究RNA定位的生理功能具有重要意義。

A.RT-qPCR detection of the expression of cytoplasmic localized RNAs,**P<0.001 compared with SNE; B.RT-qPCR detection of the expression of soluble nuclear localized RNAs,*P<0.05,**P<0.001 compared with CE

目前研究表明， RNA定位并局部翻譯的調(diào)控模式在細胞生命活動中具有極大優(yōu)勢，首先，使基因表達在細胞質(zhì)中受空間限制；其次，在局部刺激下，mRNA精準定位可在刺激原位迅速調(diào)控翻譯水平,高效實現(xiàn)細胞對刺激的應答反應；第三，RNA定位的模式對于細胞來說十分經(jīng)濟，定位于亞細胞的mRNA可被多次翻譯，產(chǎn)生大量蛋白質(zhì)[12]。由此可見，RNA精準定位對于細胞正常生理功能具有重要意義。

本研究初步描繪了hESCs中RNA的細胞核和細胞質(zhì)定位圖譜，揭示了hESCs中6萬多個RNA的核質(zhì)定位詳情及特點，如細胞質(zhì)中RNA類型豐富，可能由于細胞質(zhì)為RNA翻譯、RNA與蛋白質(zhì)發(fā)揮功能的主要區(qū)域，大多數(shù)mRNA轉(zhuǎn)錄后被運輸至細胞質(zhì)進行翻譯；也有很多ncRNA在胞質(zhì)中可能發(fā)揮調(diào)控功能。而細胞核中定位大量mRNA，分析原因可能是轉(zhuǎn)錄后正在進行加工以及轉(zhuǎn)運出核的RNA；也有一些成熟的mRNA定位于胞核中，這些mRNA可能是作為“備用池”(reserve pools)發(fā)揮功能，在細胞中有一些基因的轉(zhuǎn)錄以爆發(fā)的形式發(fā)生，而將這部分mRNA儲存于核中可以緩沖胞質(zhì)中這些轉(zhuǎn)錄本的水平，從而減少轉(zhuǎn)錄噪聲帶來的基因表達變異[13]；此外猜測可能有一部分mRNA在細胞核中具有某些調(diào)控功能。這些RNA定位特點對既往RNA核質(zhì)定位認知進行了一定的補充。

同時發(fā)現(xiàn)特異性定位于細胞質(zhì)的RNA多于細胞核，且這些RNA類型與整體定位的RNA類型不同，特異性定位于胞質(zhì)中的mRNA占比很高，超過90%；而細胞核中也有很多mRNA特異性定位于此，占核中特異性RNA的41%，這些mRNA翻譯的蛋白可能更傾向于定位至核散斑與核漿處來發(fā)揮功能[14]，也可能存在未知的調(diào)控功能，如NKTR在自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)中編碼膜錨定的蛋白，存在于NK細胞表面促進它們與靶細胞的結(jié)合，但NKTR在hESCs中定位于細胞核，這提示該mRNA可能在hESCs中具有未知的功能?？梢妋RNA、ncRNA的核質(zhì)定位不由RNA類型決定，更可能是通過其自身序列特點、結(jié)構(gòu)特點或其他調(diào)控因子等調(diào)控其定位。

目前研究表明RNA的核質(zhì)定位可通過多種因素共同調(diào)控實現(xiàn)，如RNA序列中的定位元件可調(diào)控RNA出核或滯留核中，如大部分mRNA的3′UTR區(qū)有出核序列，而很多長鏈非編碼RNA中具有核滯留順式元件，這些序列可被特定的RNA結(jié)合蛋白(RNA binding protein，RBP)識別并結(jié)合，調(diào)控RNA出核或核滯留，使其準確定位并發(fā)揮功能。因此RNA的定位元件與轉(zhuǎn)運RBP將共同調(diào)控RNA的定位，此外RNA的一些修飾水平、RNA選擇性剪接、RNA3′端選擇性加尾等也將影響RNA的核質(zhì)定位[15]。研究這些RNA特異定位在細胞核與細胞質(zhì)的機制是本課題進一步的研究方向。

綜上，本研究展示了很多有趣新穎的RNA在細胞核和細胞質(zhì)定位，全面描繪了hESCs細胞核和細胞質(zhì)中RNA定位圖譜，為進一步探索hESCs中RNA精確的定位圖譜提供了基礎。