朱勇斌 方金涌 鄭銘城 王梵燁

【摘要】 目的：探討267例行支氣管鏡檢查患兒的肺泡灌洗液的病原學(xué)分布特征。方法：選取2016年7月-2019年12月于本院行支氣管鏡檢查的患兒267例。所有患兒均行支氣管鏡檢查并留取肺泡灌洗液，分別做抗酸染色、結(jié)核桿菌聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、細(xì)菌培養(yǎng)、肺炎支原體及肺炎衣原體RNA-PCR檢查。觀察各檢查結(jié)果、分析致病菌分布及主要致病菌耐藥性。結(jié)果：267例患兒中抗酸染色陽(yáng)性2例（0.75%）;結(jié)核桿菌PCR檢測(cè)陽(yáng)性4例（1.50%）;肺炎支原體及肺炎衣原體RNA-PCR陽(yáng)性79例（29.59%）;細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性84例（31.46%）。84例細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性中主要致病菌為肺炎鏈球菌（38.10%）、流感嗜血桿菌（32.14%）、金黃色葡萄球菌（9.52%）、卡他莫拉菌（5.95%）、肺炎克雷伯菌（4.76%）及大腸埃希菌（3.57%）。流感嗜血桿菌對(duì)復(fù)方新諾明與左氧氟沙星耐藥性均較高;肺炎克雷伯菌與卡他莫拉菌均對(duì)復(fù)方新諾明耐藥性最高;大腸埃希菌對(duì)復(fù)方新諾明、頭孢他啶及頭孢曲松耐藥性均較高。肺炎鏈球菌對(duì)紅霉素與四環(huán)素耐藥性較高;金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素耐藥性最高。金黃色葡萄球菌多重耐藥比例最高。結(jié)論：267例支氣管鏡檢查患兒的肺泡灌洗液病原菌分布廣泛，主要致病菌為肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌及金黃色葡萄球菌，且對(duì)多種抗菌藥物耐藥性不同，其中金黃色葡萄球菌多重耐藥較為常見。

【關(guān)鍵詞】 支氣管鏡檢查 肺泡灌洗液 病原學(xué)

[Abstract] Objective： To investigate the etiological distribution of alveolar lavage fluid in 267 children with bronchoscopy. Method： A total of 267 children underwent bronchoscopy in our hospital from July 2016 to December 2019 were selected. All children were examined by bronchoscopy， and alveolar lavage fluid was collected for acid-fast staining， polymerase chain reaction （PCR） of tuberculosis bacteria， bacterial culture， RNA-PCR of Mycoplasma pneumoniae and Chlamydia pneumoniae. All test results were observed and the distribution and drug resistance of main pathogenic bacteria were analyzed. Result： Among the 267 cases， 2 cases （0.75%） were positive for acid-fast staining. 4 cases （1.50%） were positive for tuberculosis bacteria PCR test. 79 cases （29.59%） were Mycoplasma pneumoniae and Chlamydia pneumoniae RNA-PCR positive. 84 cases （31.46%） were positive in bacterial culture. The main pathogenic bacteria in the 84 cases with positive in bacterial culture were Streptococcus pneumoniae （38.10%）， Haemophilus influenzae （32.14%）， Staphylococcus aureus （9.52%）， Moraxella cachaca （5.95%）， Klebsiella pneumoniae （4.76%） and Escherichia coli （3.57%）. The drug resistance of Haemophilus influenzae to Compound Sulfamethoxazole and Levofloxacin was high. Both Klebsiella pneumoniae and Moraxella catarrhalis had the highest Resistance to Compound Sulfamethoxazole. Escherichia coli had high resistance to Compound Sulfamethoxazole， Ceftazidine and Ceftriaxone. Streptococcus pneumoniae has high resistance to Erythromycin and Tetracycline. Staphylococcus aureus is the most resistant to Penicillin. Staphylococcus aureus had the highest rate of multiple drug resistance. Conclusion： The pathogenic bacteria of alveolar lavage solution in 267 children with bronchoscopy were widely distributed， and the main pathogenic bacteria were Streptococcus pneumoniae， Haemophilus influenzae and Staphylococcus aureus， they have different resistance to multiple antibacterials， among which multiple drug resistance of Staphylococcus aureus was more common.

支氣管鏡是臨床檢查與診斷呼吸系統(tǒng)疾病的內(nèi)窺鏡技術(shù)，可用于肺炎、氣管異物等，兒童呼吸系統(tǒng)疾病多伴有細(xì)菌感染，治療不及時(shí)易引起呼吸衰竭、肺膿腫、胸膜炎等，嚴(yán)重威脅患兒生命安全[1-2]。臨床多采用抗菌藥物治療，但由于病原菌種類繁多，且具有多重耐藥性，臨床治療難度增大[3-4]。通過對(duì)支氣管鏡檢查肺泡灌洗液進(jìn)行病原菌分析，可快速確定致病菌類型，并分析其耐藥性，科學(xué)合理選擇藥物，有助于臨床治療[5-6]。本研究選取于本院行支氣管鏡檢查的患兒267例，旨在探討肺泡灌洗液的病原學(xué)分布特征，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年7月-2019年12月于本院行支氣管鏡檢查的患兒267例，納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)臨床表現(xiàn)、胸部X線或CT檢查確診為肺炎;經(jīng)胸部CT檢查確診為氣管異物。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并先天性心臟病、營(yíng)養(yǎng)不良或貧血;合并其他器官系統(tǒng)器質(zhì)性疾病;其他部位合并細(xì)菌感染;支氣管鏡檢查禁忌證;嚴(yán)重氣道梗阻;大咯血及嚴(yán)重出血性疾病;肺功能嚴(yán)重減退;心、腎、肝功能嚴(yán)重衰竭;一般情況太差不能耐受檢查。其中男149例，女118例;年齡1個(gè)月～13歲，平均（5.24±2.41）歲;疾病類型：肺炎215例，氣管異物52例。所有患兒家屬均知情同意并簽署知情同意書，本研究已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 支氣管鏡檢查及肺泡灌洗液采集 選擇合適的支氣管鏡，經(jīng)鼻腔插入，并進(jìn)行氣道局部麻醉，經(jīng)支氣管鏡觀察黏膜下水腫、明顯充血、分泌物潴留、異物位置等;推注5 mL 37 ℃ 0.9%氯化鈉溶液，進(jìn)行灌洗，然后將灌洗液吸出，重復(fù)3次，立即密封保存，置于4 ℃冰箱中保存待測(cè)。

1.2.2 肺泡灌洗液分析 （1）抗酸染色：將1 mL肺泡灌洗液采用滅菌紗布過濾后除去黏液，于離心管中以2 000 r/min的速度離心15 min，分離沉淀物，制作玻片，滴加石碳酸復(fù)紅初染，采用3%鹽酸乙醇進(jìn)行脫色30 s～1 min，最終用亞甲藍(lán)復(fù)染。玻片紅色者為陽(yáng)性。（2）結(jié)核桿菌聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）：取1 mL肺泡灌洗液，以15 000 r/min的速度離心5 min，分離沉淀物，并直接加入50 ?L DNA提取物，混勻后于100 ℃沸水浴10 min后，以15 000 r/min的速度離心5 min，分離得到上清液，取2 ?L做PCR反應(yīng);采用微電腦自動(dòng)基因PCR擴(kuò)增儀（北京新技術(shù)應(yīng)用研究所，型號(hào)：1109型），擴(kuò)增條件：45 s 93 ℃、45 s 55 ℃、1 min 72 ℃，共35個(gè)循環(huán)，最終至72 ℃溫度下保溫5 min;取擴(kuò)增物10 ?L，采用2%瓊脂糖凝膠，電泳20～30 min，x于紫外儀觀察，在227 bp處若發(fā)現(xiàn)橙黃色條帶則為陽(yáng)性。（3）肺炎支原體及肺炎衣原體RNA-PCR檢查：設(shè)計(jì)引物與探針序列，反應(yīng)體系為5 ?L 10×PCR buffer+4 ?L 5 mmol/L dNTP+6 ?L 25 mmol/L MgCl2+2 ?L 10 pmol/?L MPF/MPB+1.2 ?L 10 pmol/?L MPFB+2 U Taq酶+5 ?L模板，并加水至50 ?L;反應(yīng)程序?yàn)? min 93 ℃預(yù)變性，5 s 93 ℃變性，45 s 57 ℃退火，重復(fù)40個(gè)循環(huán)，并于末次循環(huán)延長(zhǎng)7 min，于37 ℃下保溫1 s。>4×105 copy/mL判定為陽(yáng)性。（4）細(xì)菌培養(yǎng)：將肺泡灌洗液以600 r/min的速度在溫度為4 ℃條件下離心5 min，棄去上清液;將標(biāo)本均質(zhì)化，采用四分區(qū)劃線接種于血瓊脂培養(yǎng)皿、麥康凱培養(yǎng)皿、巧克力培養(yǎng)皿，于35 ℃下5% CO2培養(yǎng)箱中孵育18～24 h，認(rèn)真觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)，對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行純培養(yǎng)，并采用API鑒定系統(tǒng)（法國(guó)梅里埃公司）對(duì)菌種進(jìn)行鑒定;并采用K-B瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行耐藥性試驗(yàn)。

1.3 觀察指標(biāo) （1）肺泡灌洗液檢查結(jié)果。（2）肺泡灌洗液致病菌分布。（3）主要致病菌耐藥性分析。（4）主要致病菌多重耐藥性分析。

2 結(jié)果

2.1 肺泡灌洗液檢查結(jié)果 267例患兒中抗酸染色陽(yáng)性2例（0.75%）;結(jié)核桿菌PCR檢測(cè)陽(yáng)性4例（1.50%）;肺炎支原體及肺炎衣原體RNA-PCR陽(yáng)性79例（29.59%）;細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性84例（31.46%）。

2.2 肺泡灌洗液致病菌分布 84例細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性中肺炎鏈球菌32例（38.10%），流感嗜血桿菌27例（32.14%），金黃色葡萄球菌8例（9.52%），卡他莫拉菌5例（5.95%），肺炎克雷伯菌4例（4.76%），大腸埃希菌3例（3.57%），銅綠假單胞菌2例（2.38%），鮑曼不動(dòng)桿菌1例（1.19%），博德特菌1例（1.19%），產(chǎn)氣腸桿菌1例（1.19%）。主要致病菌為肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、卡他莫拉菌、肺炎克雷伯菌及大腸埃希菌。其中檢出流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、卡他莫拉菌及肺炎克雷伯菌的肺泡灌洗液中分別有5、1、2、2例肺炎支原體RNA-PCR陽(yáng)性。

2.3 主要致病菌耐藥性分析 流感嗜血桿菌對(duì)復(fù)方新諾明與左氧氟沙星耐藥性均較高;肺炎克雷伯菌與卡他莫拉菌均對(duì)復(fù)方新諾明耐藥性最高;大腸埃希菌對(duì)復(fù)方新諾明、頭孢他啶及頭孢曲松耐藥性均較高。肺炎鏈球菌對(duì)紅霉素與四環(huán)素耐藥性均較高;金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素耐藥性最高。見表1、2。

2.4 主要致病菌多重耐藥性分析 流感嗜血桿菌多重耐藥5例（18.52%）;肺炎克雷伯菌中多重耐藥1例（25.00%）;卡他莫拉菌多重耐藥2例（40.00%）;大腸埃希氏菌中多重耐藥1例（33.33%）;肺炎鏈球菌中多重耐藥2例（6.25%）;金黃色葡萄球菌中多重耐藥4例（50.00%），其中金黃色葡萄球菌多重耐藥比例最高。

3 討論

支氣管鏡技術(shù)可有效清除氣道分泌物，防止堵塞氣道，緩解缺氧狀態(tài)，減輕呼吸道感染，同時(shí)可對(duì)肺泡灌洗液進(jìn)行病原學(xué)分析、細(xì)菌培養(yǎng)，有助于確定病原菌，選擇合理抗生素[7-9]。

本研究中267例支氣管鏡檢查患兒肺泡灌洗液中細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性84例（31.46%）。84例細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性中主要致病菌為肺炎鏈球菌（38.10%）、流感嗜血桿菌（32.14%）、金黃色葡萄球菌（9.52%）、卡他莫拉菌（5.95%）、肺炎克雷伯菌（4.76%）及大腸埃希菌（3.57%）。說明肺泡灌洗液中病原菌種類繁多，需據(jù)此選擇抗菌藥物。同時(shí)抗酸染色陽(yáng)性2例（0.75%）;結(jié)核桿菌PCR檢測(cè)陽(yáng)性4例（1.50%）;肺炎支原體及肺炎衣原體RNA-PCR陽(yáng)性79例（29.59%），且流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌等致病菌中也伴有肺炎支原體陽(yáng)性，充分表明病原菌中還包含結(jié)核桿菌、肺炎支原體等多種微生物，進(jìn)一步證實(shí)肺泡灌洗液中病原菌種類多樣性。臨床多采用抗生素對(duì)癥治療，但缺少對(duì)患兒病情的評(píng)估，且缺乏藥敏檢測(cè)指導(dǎo)，常發(fā)生抗生素濫用現(xiàn)象，或盲目升級(jí)調(diào)整，增加病原菌耐藥性[10-13]。因此在診治過程中必須給予正確評(píng)估病原菌種類及其耐藥性。

本研究對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)所發(fā)現(xiàn)致病菌進(jìn)行耐藥性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)流感嗜血桿菌對(duì)復(fù)方新諾明與左氧氟沙星耐藥性均較高;肺炎克雷伯菌與卡他莫拉菌均對(duì)復(fù)方新諾明耐藥性最高;大腸埃希菌對(duì)復(fù)方新諾明、頭孢他啶及頭孢曲松耐藥性均較高。肺炎鏈球菌對(duì)紅霉素與四環(huán)素耐藥性較高;金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素耐藥性最高。據(jù)此，臨床上應(yīng)避免選擇上述耐藥性較高藥物，從而避免抗生素使用盲目性，有助于及時(shí)、科學(xué)、合理控制肺部感染情況，緩解臨床癥狀，提高治療效果[14-15]。同時(shí)應(yīng)該注意的是，肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌等致病菌中含有多重耐藥性，能對(duì)3種及以上抗菌藥物同時(shí)產(chǎn)生耐藥，多由于病原菌體內(nèi)產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，對(duì)抗菌藥物進(jìn)行滅活，并改變靶位或細(xì)胞膜通透性，降低抗菌藥物濃度，降低療效[16-19]。感染嚴(yán)重時(shí)，可聯(lián)合應(yīng)用抗菌藥物，發(fā)揮協(xié)同作用[20]。

綜上所述，267例支氣管鏡檢查患兒的肺泡灌洗液病原菌分布廣泛，主要致病菌為肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌及金黃色葡萄球菌，且對(duì)多種抗菌藥物耐藥性不同，其中金黃色葡萄球菌多重耐藥較為常見。

參考文獻(xiàn)

[1]謝曉虹，王崇杰，劉玉琳，等.兒童肺不張支氣管鏡檢和病原學(xué)分析[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，42（12）：1681-1684.

[2]師金川，張忠東，唐猛，等.118例AIDS病人支氣管肺泡灌洗液的病原學(xué)檢測(cè)分析[J].中國(guó)艾滋病性病，2018，24（10）：974-976.

[3] Alexandra G，Claudia G.Diagnostic yield of broncho-alveolar lavage for pembrolizumab induced sarcoid-like reaction of the lung[J].Cytopathology，2019，30（6）：686-687.

[4]宋衛(wèi)娜，李曉明，宋春華.經(jīng)電子支氣管鏡采樣的支氣管肺泡灌洗液病原學(xué)檢查在小兒難治性肺炎治療中的意義[J].中國(guó)臨床實(shí)用醫(yī)學(xué)，2019，10（3）：45-47.

[5]凌宙貴.下呼吸道感染標(biāo)本的采集方法優(yōu)化研究[D].南寧：廣西醫(yī)科大學(xué)，2016.

[6]黃霞，劉峰，梁慧，等.支氣管鏡檢查在兒童支氣管擴(kuò)張?jiān)\治中的應(yīng)用[J].中華實(shí)用兒科臨床雜志，2017，32（4）：289-291.

[7]史曉云，欒海麗，張晗，等.兒童難治性肺炎支原體肺炎的支氣管鏡下特征及支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子水平的研究[J].國(guó)際兒科學(xué)雜志，2017，44（12）：867-871.

[8]江蘇安，嚴(yán)建平，洪文忠.下呼吸道感染患者纖維支氣管鏡下肺泡灌洗液培養(yǎng)的病原學(xué)分布特征研究[J].中國(guó)醫(yī)師雜志，2017，19（10）：1588-1591.

[9] Nguyen M，Brettin T，Long S，et al.Developing an in silico minimum inhibitory concentration panel test for Klebsiella pneumoniae[J].Sci Rep，2018，8（1）：421.

[10]儲(chǔ)迅濤.聚焦兒童肺炎支原體感染實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)[A].2018廣東省醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)暨第一屆南方檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C].珠海：廣東省醫(yī)學(xué)會(huì)，2018.

[11]周瑤.支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞學(xué)分析在下呼吸道感染性疾病中的臨床研究[D].湛江：廣東醫(yī)科大學(xué)，2017.

[12]李巖，韓光躍，劉艷芳，等.石家莊地區(qū)秋冬季嚴(yán)重呼吸道感染住院兒童病毒病原學(xué)研究[J].中國(guó)病毒病雜志，2017，7（1）：18-22.

[13]周銘.經(jīng)纖維支氣管鏡鹽酸氨溴索灌洗治療小兒重癥肺炎的療效觀察[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)刊，2018，45（24）：120-121.

[14]周潔.嬰幼兒重癥肺炎支氣管肺泡灌洗液病原學(xué)分析[D].衡陽(yáng)：南華大學(xué)，2016.

[15]徐鳳琴，張琪，畢良學(xué).支氣管肺泡灌洗液肺炎支原體核酸聯(lián)合血清特異性IgM檢測(cè)對(duì)兒童肺炎支原體感染的診斷價(jià)值[J].臨床肺科雜志，2018，23（1）：35-37.

[16]辛美云，韓蕾，李建偉.重癥金黃色葡萄球菌肺炎臨床及纖維支氣管鏡下病變特點(diǎn)分析[J].中國(guó)小兒急救醫(yī)學(xué)，2018，25（10）：791-793.

[17]袁遠(yuǎn)宏，張慧，張新萍，等.纖維支氣管鏡肺泡灌洗對(duì)重癥肺炎機(jī)械通氣患兒療效觀察[J].中國(guó)小兒急救醫(yī)學(xué)，2019，26（1）：27-31.

[18]李學(xué)青，王麗娜，張俐，等.肺泡灌洗液二代基因測(cè)序?qū)和匕Y肺炎病原學(xué)診斷應(yīng)用觀察[J].中國(guó)實(shí)用兒科雜志，2019，34（6）：513-516.

[19]葉麗珍，張永紅，楊源，等.支氣管鏡肺泡灌洗治療小兒重癥肺炎[J].吉林中醫(yī)藥，2017，37（12）：1240-1241.

[20]沈丹琪.纖維支氣管鏡在兒童慢性咳嗽診療中的應(yīng)用研究[D].沈陽(yáng)：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)，2017.

（收稿日期：2020-02-25） （本文編輯：田婧）