溫琳瓊 姜萍 師秀艷

【摘要】 目的：對一并多指（趾）家系進行基因突變檢測，以期發(fā)現(xiàn)致病基因突變。方法：提取家系可追溯到的并多指（趾）患者外周血的基因組DNA。以特異的引物經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴增HOXD13基因的兩個外顯子及外顯子/內(nèi)含子交界區(qū)域，然后對PCR產(chǎn)物直接進行測序。BLAST比對分析家系患者HOXD13基因序列。突變導(dǎo)致的氨基酸改變位點在不同物種的保守性分析。結(jié)果：BLAST比對分析發(fā)現(xiàn)患者突變?yōu)閏.64G>T（p.A22S），該突變位點在不同生物中高度保守。結(jié)論：c.64G>T（p.A22S）可能為該家系的致病突變。

【關(guān)鍵詞】 肢端畸形 突變篩查 并多指（趾）畸形

[Abstract] Objective： To find out the mutation of pathogenic gene， the gene mutation of a pedigree with synpolydactyly was detected. Method： Genomic DNA from peripheral blood of patients with traceable polydactyly was extracted. Two exons and exon / intron junction regions of HOXD13 gene were amplified by polymerase chain reaction with specific primers， and then the PCR products were sequenced directly. BLAST was used to compare the HOXD13 gene sequence of patients with genebank sequence. Evolutionary conservation of amino acids flanking the mutations were analyzed. Result： The comparative analysis of BLAST revealed that the patient was mutated to c.64G > T （p.A22S）， which was highly conserved in different organisms. Conclusion： c.64G > T （p.A22S） may be a pathogenic mutation in this family.

并多指畸形（synpolydactyly， SPD）是一種常染色體顯性肢體畸形，通常由3/4指和4/5趾并指組成，3/4并指蹼內(nèi)有一個中心重復(fù)指。SPD（OMIM 186000），是由HOXD13基因突變引起的，HOXD13是肢體發(fā)育中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子。HOXD13有兩個外顯子：外顯子1編碼含15個丙氨酸殘基的多聚丙氨酸鏈，外顯子2編碼含有60個氨基酸殘基的同源盒結(jié)構(gòu)域（殘基268-327）。通過同源結(jié)構(gòu)域結(jié)合特定的DNA序列，HOXD13直接調(diào)節(jié)早期肢體前-后軸和相關(guān)的關(guān)鍵基因[1]。HOXD13蛋白的多聚丙氨酸鏈延展突變和同源結(jié)構(gòu)域錯義突變都可引起SPD表型。本研究中分析了一個中國北方SPD家系，以HOXD13為候選致病基因?qū)ο茸C者進行了基因突變篩查，以期發(fā)現(xiàn)突變位點，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 家系臨床資料 于沈陽醫(yī)學(xué)院中心醫(yī)院手外科收集一并多指（趾）家系，通過直接檢查或家系成員口述，了解患者的臨床表現(xiàn)及其遺傳學(xué)特征，繪制系譜圖;與患者及其家屬簽署“知情同意書”，并經(jīng)沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)術(shù)委員會批準，對可追溯到的患者進行體格檢查和足部外觀拍照，并采集患者外周靜脈血2 mL，血樣-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 突變篩查 采用全血基因組DNA提取試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司）提取基因組DNA。由上海生工生物公司合成三對PCR引物：E1-1F2/E1-1R2，E1-2F/E1-2R和E2F/E2R引物序列，退火溫度和擴增片段長度見表1。采用即用型Taq酶PCR試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司）進行50 μL標準體系（Mix 25 μL， 模板2.5 μL，上、下游引物各2.5 μL，ddH2O 17.5 μL）的PCR反應(yīng)，擴增包含HOXD13基因的兩個外顯子及外顯子/內(nèi)含子交界區(qū)的三個DNA片段，反應(yīng)條件為：94 ℃溫度下變性5 min，退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定;經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)觀察，并對擴增的強度和特異性進行初步估計，擴增成功的PCR產(chǎn)物送測序。

E2R AAGCTGTCTGTGGCCAACC

1.3 測序結(jié)果分析 與野生型測序圖對比觀察分析患者測序圖，根據(jù)測序圖提示的堿基序列在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast做同源性比較分析，確定堿基改變位置。根據(jù)已知HOXD13的基因開放閱讀框，推測堿基改變是否影響mRNA剪切，或者導(dǎo)致編碼氨基酸變化。檢索SNP數(shù)據(jù)庫，確定是否為已報道的單核苷酸多態(tài)性。

1.4 突變位點對應(yīng)氨基酸在不同物種的保守性分析 利用UCSC在線搜索工具（http：//genome.ucsc.edu/cgi-bin）來分析堿基改變所對應(yīng)的氨基酸位點在不同物種之間的序列保守性。以推測對應(yīng)氨基酸位點突變是否會引起肢端畸形。

2 結(jié)果

2.1 家系臨床資料 本研究收集到的這一SPD家系共有2代患者，現(xiàn)存家系成員4人，其中患者2人（圖1）。先證者為5歲女孩，其右足5趾多趾畸形（圖2）。據(jù)家屬陳述患兒父親為左足4/5并趾畸形。無隔代遺傳現(xiàn)象，男女患者均有受累，患者子代約1/2發(fā)病。家系畸形僅限于手足，患者除手足外無其他發(fā)育異常，手腕、腳踝活動未見異常，身高正常。

2.2 測序結(jié)果及分析 以Ⅱ-1患者基因組DNA為模板，擴增HOXD13基因的兩個外顯子及外顯子/內(nèi)含子交界區(qū)的三個DNA片段，PCR產(chǎn)物直接測序，HOXD13基因開放閱讀框第64位堿基發(fā)生顛換突變c.64G>T測序圖（見圖3），該突變將導(dǎo)致mRNA第22位密碼子GCC突變?yōu)門CC，相應(yīng)HOXD13蛋白第22位氨基酸發(fā)生突變，從非極性丙氨酸（Ala， A）轉(zhuǎn)化成極性絲氨酸（Ser， S），即p.A22S。

2.3 突變位點對應(yīng)氨基酸在不同物種的保守性分析 HOXD13蛋白第22位的丙氨酸p.A22在不同物種之間的高度保守，見圖4。說明這一氨基酸位點對于HOXD13蛋白質(zhì)的功能至關(guān)重要。

3 討論

本研究收集到的這一中國北方SPD家系已經(jīng)穩(wěn)定遺傳了至少2代，呈連續(xù)傳遞現(xiàn)象，且男女均有發(fā)病，該家系符合常染色體顯性遺傳模式。兩代患者表型不同，但都符合SPD的典型表型。SPD是一種以手指或腳趾不完全分離和手指或腳趾數(shù)目增多為主要特征的遺傳性遠端肢體畸形。SPD主要是由HOXD13蛋白的多聚丙氨酸延展長度超過7個引起的。多聚丙氨酸延展導(dǎo)致SPD的機制，目前普遍認為突變蛋白自身不能入核，而且突變蛋白影響野生型HOXD13及其他5HOXD蛋白的功能。因此其致病機制為顯性負效應(yīng)，突變蛋白半衰期變短[2-3]。除多聚丙氨酸鏈延展突變外，HOXD13基因同源盒結(jié)構(gòu)域的突變也可導(dǎo)致并多指（趾）的發(fā)生[4]。在2016年，我國學(xué)者也在一個中國家系中發(fā)現(xiàn)了HOXD13基因同源異型結(jié)構(gòu)域的錯義突變引起的SPD畸形[5-7]。同源盒結(jié)構(gòu)域突變的HOXD13不能結(jié)合DNA，這類表型可能是由HOXD13的單倍體不足引起的。

2012年Brison等[8]報道了第一例HOXD13蛋白N-端非多聚丙氨酸區(qū)域的HOXD13G11A突變，突變蛋白沒有改變亞細胞定位、DNA結(jié)合能力和轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，但是與野生型相比，蛋白質(zhì)半衰期顯著下降、HOXD13G11A與GLI3R在前部肢芽的親和力增強導(dǎo)致GLI3R過早降解。GLI3是調(diào)控人類肢芽發(fā)育的前后軸方向的重要信號分子[9-12]。GLI3蛋白具有特異的DNA親和力，是肢體發(fā)育早期重要的轉(zhuǎn)錄因子[13-15]。GLI3是肢體發(fā)育過程中的主要調(diào)控因子，在拇指即將形成的區(qū)域，GLI3被加工成截短蛋白GLI3R，GLI3R增強細胞凋亡并抑制手指的形成。SHH抑制GLI3向GLI3R阻遏物形式的截短，從而產(chǎn)生GLI3激活物/GLI3R阻遏物梯度[16-17]。功能上冗余的5HOXD基因調(diào)控手指模式，位于SHH和GLI3下游。HOX基因表達錯誤、SHH梯度異?；騁LI3和GLI3R之間失去平衡都與手指畸形相關(guān)[18-21]。Brison等[8]等研究推測突變蛋白HOXD13G11A半衰期顯著下降和HOXD13G11A與GLI3R在前部肢芽的親和力增強是該家系致病原因。本文報道的c.64G>T突變是繼Brison等[8]報道的HOXD13G11A N-末端非多聚丙氨酸的又一例N端突變。該突變導(dǎo)致22位氨基酸從非極性丙氨酸轉(zhuǎn)化成極性絲氨酸，該氨基酸位點HOXD13A22S在不同物種間高度保守，提示c.64G>T突變可能為致病突變。突變HOXD13A22S是否會改變蛋白半衰期以及突變蛋白與GLI3R因子之間相互作用是否有變化，這些都需要進一步研究。

綜上所述，HOXD13基因突變與SPD發(fā)病密切相關(guān)，HOXD13蛋白C-末端同源盒結(jié)構(gòu)域、N-末端多聚丙氨酸延展和非多聚丙氨酸延展區(qū)域的突變都可以導(dǎo)致其功能異常，從而導(dǎo)致SPD。SPD家系中致病基因突變鑒定對于臨床開展遺傳咨詢和優(yōu)生指導(dǎo)都有重要意義。

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（收稿日期：2019-12-06） （本文編輯：姬思雨）