李廣貴 林國都 胡玉乾 張懷山 白靜 安華明 魯敏

摘要：高含量的維生素C是刺梨果實的重要性狀，挖掘與維生素C含量相關聯(lián)的基因序列變異及單倍型對刺梨的品種改良具有指導意義。在21份野生刺梨資源中對GGP和DHAR基因進行PCR擴增和測序，分析基因序列多態(tài)性及其與果實維生素C含量的相關性。GGP基因在21份野生刺梨中共擴增出長度為2 035 bp的同源序列，其中包含22處變異位點，產生15種單倍型，在0.01顯著性水平上，3個單核苷酸多態(tài)性（SNP）及Hap15與刺梨果實高含量維生素C相關;在0.05顯著性水平上，3個SNP及Hap7與刺梨果實低含量維生素C相關;GGP基因單倍型存在網(wǎng)狀進化。DHAR基因在21份野生刺梨中共擴增出長度為1 609 bp的同源序列，其中包含69處變異位點，產生9種單倍型，在0.05顯著性水平上，8個SNP、9個InDel及Hap9與刺梨果實中低含量維生素C相關，1個SNP及單倍型Hap4～Hap6與刺梨果實中高含量維生素C相關;DHAR基因單倍型呈現(xiàn)扇形進化。GGP基因具有更高的單倍型多樣性，DHAR基因具有更高的DNA多態(tài)性;GGP基因特異單倍型Hap15和DHAR基因特異單倍型Hap4共同存在于刺梨中時，可以使果實維生素C含量表現(xiàn)為高的狀態(tài);而GGP基因特異單倍型Hap7和DHAR基因單倍型Hap9同時存在于刺梨中時，可以使果實維生素C含量表現(xiàn)為低的狀態(tài)。

關鍵詞：刺梨;維生素C;GGP基因;DHAR基因;基因序列多態(tài)性;單倍型;關聯(lián)分析

中圖分類號： S661.203.2文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）08-0063-07

收稿日期：2019-03-08

基金項目：國家自然科學基金（編號：31660558）;貴州省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃（編號：2018053）;貴州大學SRT計劃（編號：2018244）。

作者簡介：李廣貴（1996—），男，貴州六盤水人，主要從事刺梨分子育種研究。E-mail：1119366514@qq.com。

通信作者：魯?敏，博士，副教授，主要從事果樹生物技術與遺傳育種研究。E-mail：48181266@qq.com。

刺梨（Rosa roxburghii Tratt.）為薔薇科薔薇屬植物，原產于中國，因果實富含維生素C而成為研究維生素C代謝的熱門材料。研究表明，在所有合成路徑中，L-半乳糖途徑的GDP甘露糖表異構酶（GME）基因的表達變化最能反映維生素C積累速率的變化;超量表達RrGME基因的擬南芥葉片中維生素C平均濃度提高了6.2倍;而循環(huán)途徑的脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）基因的表達變化與維生素C的積累變化相似性最高，超量表達RrDHAR的擬南芥葉片中維生素C平均濃度提高了9.7倍[1]。筆者所在課題組研究發(fā)現(xiàn)刺梨中L-半乳糖途徑的半乳糖醛酸內酯脫氫酶（GLDH）和GDP半乳糖磷酸化酶（GGP）基因的表達特點與維生素C積累高度一致，進一步將它們在煙草中過量表達使煙草葉片中的維生素C含量分別提高了1.1倍和20倍[2-4]。從受體植物維生素C含量的增加程度來看，RrGGP和RrDHAR等2個基因應優(yōu)先當選為刺梨維生素C代謝的關鍵酶基因，但有關它們在基因序列上的差異與維生素C含量之間的關聯(lián)關系并不清楚。

關聯(lián)分析（association analysis）是一種以連鎖不平衡為基礎，研究群體基因型多態(tài)性與表型變異相關性，發(fā)掘和定位基因，并對基因及其等位基因進行功能分析的重要工具[5]。根據(jù)掃描范圍，關聯(lián)分析可分為全基因組和候選基因2種途徑。湯佳樂等利用70對覆蓋全基因組的SSR引物，發(fā)現(xiàn)了與獼猴桃葉片及果實中的維生素C含量關聯(lián)的5個優(yōu)異標記位點[6]。筆者所在課題組雖然前期也開發(fā)了大量SSR引物[7-11]，但由于缺乏刺梨遺傳連鎖圖譜數(shù)據(jù)，因此在SSR引物的選擇上具有隨機性，目前尚未篩選到與刺梨維生素C含量相關聯(lián)的SSR標記位點。針對這種現(xiàn)狀，候選基因關聯(lián)分析是更適合刺梨的研究策略。而在蘋果上已有研究證明，GGP基因內的單核苷酸多態(tài)性（SNP）是影響果實維生素C含量的主要決定因素[12]。因此，本研究對候選基因RrGGP和RrDHAR進行基因序列多態(tài)性分析，并進一步與維生素C含量進行關聯(lián)分析，為刺梨遺傳改良提供理論依據(jù)和分子工具。

1?材料與方法

1.1?材料

試驗于2017、2018年8—9月進行。從貴州省11個縣（市）采樣20份，四川省冕寧縣采樣1份（表1），樣本間距離大于50 m。每個采樣株均有全球定位系統(tǒng)（GPS）定位，并詳細記錄經(jīng)度、緯度、海拔高度。每株采取幼嫩葉片和成熟度及大小一致的有代表性的果實，以株為單位裝入做好標記的自封袋中，放在冰盒內，及時帶回實驗室，經(jīng)液氮處理后于-70 ℃超低溫冰箱中冷凍保存，備用。

1.2?DNA提取和PCR擴增

試驗材料基因組DNA的提取采用CTAB法[13]。GGP基因擴增引物序列為正向5′-CATGCCATGGATGTTGAGGATCAAGAGGGTTCCCACTAT-3′，反向5′-GCTCTAGAACATAAACCCAAACG-3′[4]，DHAR基因擴增引物序列為正向5′-CCACCTCATAAACTTGGCTGACA-3′，反向5′-TGTTTCTCTTCAGCGATGGTCTT-3′[1]，交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應體系為40 μL，其中包括2×Mix 20 μL;ddH2O 16 μL;10 μmol/L的 Primer-F 及Primer-R各 1 μL;50 ng/μL的DNA模板2 μL。擴增程序為 94 ℃ 預變性4 min;然后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94 ℃變性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸 90 s;最后72 ℃延伸10 min。擴增產物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，觀察拍照后送上海生工生物工程技術有限公司進行雙向測序。將測序結果與GenBank中的序列利用BLAST工具（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）進行比對，以確認擴增結果的正確性。

1.3?AsA含量測定

參照白靜等的方法[14]，AsA含量采用高效液相色譜法測定。

1.4?數(shù)據(jù)分析

利用Lasergene 7.0軟件對正反向序列進行拼接，參照Chromas序列峰圖對誤讀點進行人工校正，并用軟件Clustal X進行多序列對比[15]。利用DnaSP v5.1軟件進行GGP和DHAR基因核酸多態(tài)性分析和單倍型分析[16]，以Network 5.0軟件構建單倍型網(wǎng)絡圖;利用Structure 2.3.4軟件計算其最佳群體值K=2，取此時的群體結構Q值作為協(xié)變量，以Tassel 2.1軟件進行GGP和DHAR基因核酸多態(tài)性與果實維生素C含量的關聯(lián)分析。

2?結果與分析

2.1?基因序列多態(tài)性分析

GGP基因在21份野生刺梨中共擴增出長度為2 035 bp的同源序列，其中包含22處變異位點，11處為插入缺失標記（Insert/Delete，InDel）類型，11個為SNP類型;DHAR基因在21份野生刺梨中共擴增出長度為 1 609 bp 的同源序列，其中包含69處變異位點，53處為InDel類型，16個為SNP類型（表2）。DHAR基因具有較高的DNA多態(tài)性，多態(tài)性核苷酸位點數(shù)量、核苷酸差異平均數(shù)（k）、核苷酸多樣度（Pi）等參數(shù)分別為69、5.123 81和0.003 29。而GGP基因具有更高的單倍型多樣性，單倍型數(shù)量（Ha）、單倍型多樣度（Hd）等參數(shù)分別為15和0.900。

2.2?基因序列多態(tài)性及其與果實AsA含量的關聯(lián)分析

對于GGP基因而言（表3），在0.01顯著性水平上，所檢測22處變異位點中，有3個SNP（267 T/A，305 T/G，420 G/T）與刺梨果實維生素C含量相關，解釋率為0.319 1，在267 bp處為A堿基，305 bp 處為G堿基，420 bp處為T堿基是Hap15特有變異，它對應的材料ZY-29在所有材料中維生素C含量最高，為 2 590.47 mg/100 g，表明Hap15可能控制刺梨果實高維生素C含量。在0.05顯著性水平上，有5處變異與刺梨果實維生素C含量相關，其中3處為InDel類型（639-/G，989-/T，1 215-/T），2處為SNP類型（1 354 C/G，1 355 T/C），在639 bp處為G堿基，1 354 bp 處為G堿基，1 355處為C堿基是Hap7的特有變異，它對應的材料LD-7中維生素C含量僅為987.59 mg/100 g，屬偏低水平，表明Hap7可能控制刺梨果實低維生素C含量。

對于DHAR基因而言（表4），在0.05顯著性水平上，所檢測的69處變異位點中，有19處與刺梨果實維生素C含量相關，其中9處為InDel類型（399A/-，1 370-1 377 TCTGTAAG/—），10處為SNP類型（20 T/G，382 G/C，497 T/G，581 C/T，720 T/G，837 G/T，1 397 A/T，1 440 T/C，1 595 C/A，1 596 C/T，1 597 G/A）;在20 bp處為G堿基，382 bp 處為C堿基，399 bp處為缺失，497 bp處為G堿基，581 bp處為T堿基，720 bp處為G堿基，1 370～1 377 bp處插入TCTGTAAG，1 397 bp處為T堿基，1 595 bp處為A堿基，1 597 bp處為A堿基是單倍型Hap9的特有變異，它對應的材料為 LD-7、XY-24、BJ-3、AL-20，維生素C含量范圍982.62～1 543.1 mg/100 g，平均值1 171.15 mg/100 g，屬中偏低水平，表明單倍型Hap9控制中低水平的AsA含量;1 440 bp處為C堿基是單倍型Hap4～Hap6的共有變異，對應的材料ZY-29、MN-7、AL-17中AsA含量分別為2 590.47、1 652.57、1 668.35 mg/100 g，屬中偏高水平，表明單倍型Hap4～Hap6可能控制中高水平AsA含量。

綜合GGP基因和DHAR基因核苷酸多態(tài)性及單倍型結果來看（表3、表4），GGP基因特異單倍型Hap15和DHAR基因特異單倍型Hap4同時在高含量維生素C材料ZY-29中檢測到，表明這2種單倍型共同存在于刺梨中時，可以使果實維生素C含量表現(xiàn)為高的狀態(tài);而GGP基因特異單倍型Hap7和DHAR基因單倍型Hap9同時存在于低含量維生素C材料 LD-7中，表明這2種單倍型共同存在于刺梨中時，可以使果實維生素C含量表現(xiàn)為低的狀態(tài)。

2.3?單倍型間的進化分析

將所檢測到的15條野生刺梨GGP基因和9條DHAR基因單倍型序列，通過Network軟件構建了Median Joining網(wǎng)絡聚類（圖1、圖2）。對于GGP基因而言，單倍型存在網(wǎng)狀進化，Hap1位于網(wǎng)絡圖輻射化的中心，且包含了7個個體（表3），占試驗材料的33.33%，分布最廣，是主要單倍型，可推測該單倍型為原始單倍型或祖先單倍型，其余Hap2～Hap15均為特有單倍型，僅存在于1個個體中（表3），Hap2、Hap5、Hap7、Hap8、Hap10、Hap11、Hap14、Hap15位于發(fā)散網(wǎng)絡圖的末端，說明它們是較晚發(fā)生變異而產生的單倍型。對于DHAR基因而言，單倍型進化軌跡類似扇形，Hap1位于扇狀圖起始位點，包含8個個體（表4），占試驗材料的38.10%，分布最廣，是主要單倍型，可推測該單倍型為原始單倍型或祖先單倍型，Hap3、Hap8、Hap9為共享單倍型，Hap2、Hap4～Hap7為特有單倍型，僅存在于1個個體中（表4），Hap2、Hap6、Hap7、Hap9位于發(fā)散網(wǎng)絡圖的末端，說明它們是較晚發(fā)生變異而產生的單倍型。GGP基因和DHAR基因網(wǎng)絡圖中出現(xiàn)的mv均表明一些單倍型在進化過程中發(fā)生了丟失。

3?討論

在21份刺梨野生種質中，ZY-29采于貴州省遵義市，位于最東端，在GGP基因和DHAR基因中呈現(xiàn)特異單倍型，分別為Hap15和Hap4;MN-7采于四川省冕寧縣，位于最西端，在GGP基因和DHAR基因中也呈現(xiàn)特異單倍型，分別為Hap8和Hap5。對GGP基因而言，東西兩端的試驗材料ZY-29和MN-7對應的單倍型Hap15和Hap8在系統(tǒng)進化圖上也位于相反的分枝上，表明GGP基因單倍型的進化可能與地理位置具有一定的相關性;而對DHAR基因而言，東西兩端的試驗材料ZY-29和MN-7對應的單倍型Hap4和Hap5在系統(tǒng)進化圖上位于同一分枝，并進化出Hap6（圖2），說明DHAR基因單倍型的進化可能不受地理條件的影響。

維生素C積累的遺傳調控非常復雜，對維生素C代謝通路中的關鍵酶或限速步驟的研究即使在同一植物中也會存在差異[17-18]，在刺梨中也有相同的情況發(fā)生，從表觀遺傳學的角度，GGP和DHAR基因是爭議的焦點[1，4]。本研究通過分析刺梨GGP和DHAR基因在不同種質中DNA序列的差異，從DNA水平研究2個基因與果實維生素C含量的關聯(lián)性，在0.01水平上，僅GGP基因中的3個SNP顯著地影響刺梨果實維生素C含量，但這3個位點均發(fā)生在內含子區(qū)域;在0.05水平上，則GGP和DHAR基因均存在與果實維生素C含量顯著關聯(lián)的變異位點，證明GGP和DHAR都是影響刺梨果實維生素C含量的關鍵基因，它們在DNA水平和表觀遺傳學方面都發(fā)揮了積極作用，在表觀遺傳學上，GGP基因是合成途徑的關鍵基因，而DHAR基因是循環(huán)再生途徑的關鍵基因。從DNA水平上來說，GGP基因具有更高的單倍型多樣性，DHAR基因具有更高的DNA多態(tài)性。DHAR基因在21個材料中產生了69處變異位點，其中53處為InDel類型（表2），涉及2段ATGCTATTCAAATGAATGAAGT序列，但這2段變異并未與刺梨果實維生素C含量顯著關聯(lián)（表4），而當TCTGTAAG序列存在于DHAR基因時，刺梨果實可能維生素C含量較低。總之，刺梨果實維生素C含量可能由GGP和DHAR基因共同控制，當GGP基因特異單倍型Hap15和DHAR基因特異單倍型Hap4共同存在于刺梨中時，可以使果實維生素C含量表現(xiàn)為高的狀態(tài);而GGP基因特異單倍型Hap7和DHAR基因單倍型Hap9同時存在于刺梨中時，可以使果實維生素C含量表現(xiàn)為低的狀態(tài)。

目前，刺梨在貴州的種植面積已達 13.33萬hm2，并計劃到2020年增加到 33.33萬hm2，但真正用于栽培的僅貴農5號，隨著刺梨高端產業(yè)的發(fā)展，市場需求更高AsA含量的品種，但以此為育種目標的品質改良尚未真正開展，因此，本研究將對培育我國專用刺梨品種、加快刺梨品質育種進程起到一定的推動作用。

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