朱海生 李祖亮 李永平 劉建汀 王彬 陳敏氡 溫慶放

摘要：為了建立一種高效、準確的普通絲瓜品種純度檢測方法，以普通絲瓜絲盛2號及其親本為試驗材料，利用SSR分子標記技術(shù)鑒定雜交種種子純度，從106對SSR引物中篩選出1對引物（SGSSR4），其在雜交種和雙親之間存在顯著差異條帶，且雜交種含有父、母本的特異互補帶型。利用該引物對26株絲盛2號雜交種進行純度鑒定，鑒定結(jié)果為96.15%，與大田種植鑒定結(jié)果一致，表明該引物可用于絲盛2號雜交一代種子純度的快速檢測和準確鑒定。

關(guān)鍵詞：普通絲瓜;ISS分子標記;種子純度;鑒定

中圖分類號： S642.403.6文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）08-0053-03

收稿日期：2019-04-03

基金項目：福建省自然科學基金（編號：2019J011112）;福建省科技計劃項目-省屬公益類科研院所基本科研專項（編號：2018R1026-5）;福建省農(nóng)業(yè)科學院“青年科技英才百人計劃”（編號：YC2017-5）;中央引導地方科技發(fā)展專項（編號：2018L3005）;福建省農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新團隊建設(shè)項目（編號：STIT2017-1-2）;國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系福州綜合試驗站項目（編號：CARS-23-G-53）。

作者簡介：朱海生（1978—），男，安徽樅陽人，博士，研究員，主要從事蔬菜生物技術(shù)與育種方面的研究。E-mail：zhs0246@163.com。

絲瓜（Luffa cylindrica）起源于印度，主要分布于溫帶、熱帶和亞熱帶地區(qū)，為葫蘆科（Cucurbitaceae）絲瓜屬（Luffa Mill.）一年生攀緣藤本植物，是我國最主要的瓜類蔬菜之一，在我國各地均有大面積栽培[1]。絲瓜屬主要有8個種，普通絲瓜（俗稱肉絲瓜）是其中最為重要的栽培種之一，我國大部分地區(qū)以栽培普通絲瓜為主[2-3]。普通絲瓜肉質(zhì)清香軟滑，營養(yǎng)價值高，同時具有天然保健及藥用價值，深受廣大消費者喜愛，其栽培面積和需求量正在不斷增大，具有巨大的經(jīng)濟潛力和廣闊的應用前景。利用雜種優(yōu)勢，培育一代雜交絲瓜品種是目前普通絲瓜育種的主要方法。由于在普通絲瓜雜交制種過程中，人工去雄不徹底或漏去雄等原因，常會出現(xiàn)假雜交種，導致種子遺傳純度降低，給生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失。因此，雜交種品種純度和種子真實性準確、簡便、快速鑒定成為普通絲瓜生產(chǎn)中最為迫切解決的問題之一。

分子生物學的迅速發(fā)展，使從DNA分子水平上對品種純度進行基因鑒定和分析成為可能。采用分子標記技術(shù)進行種子純度鑒定是一種快速、便捷、準確、有效的方法。微衛(wèi)星序列即簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）分子標記，廣泛存在于真核和原核生物基因組中。SSR分子標記具有重復性好、穩(wěn)定可靠、位點特異、復等位、呈共顯性等優(yōu)點，已經(jīng)成為最為廣泛的分子標記之一[4-5]，也是目前作物品種鑒定和種子純度鑒定研究中最常用的標記之一[6-7]。本研究利用SSR分子標記技術(shù)，篩選出特異性SSR引物，建立了一套快速檢測普通絲瓜種子純度的方法，以期為準確快速、簡單高效的普通絲瓜雜交種子純度鑒定提供參考。

1?材料與方法

1.1?普通絲瓜轉(zhuǎn)錄組測序與SSR分子標記篩選

普通絲瓜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源于筆者所在課題組Illumina高通量深度測序結(jié)果。委托基迪奧生物科技有限公司進行RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組測序，利用Primer 3.0對含SSR位點序列進行引物設(shè)計，引物序列長度18～25 bp，擴增產(chǎn)物長度100～280 bp，GC含量40%～60%，退火溫度55～65 ℃，隨機選擇其中20 bp以上SSR序列的150對標記進行合成，進行SSR-PCR擴增以驗證其有效性。

1.2?材料及其DNA提取

供試材料為普通絲瓜絲盛2號雜交種及其父母本，為福建省農(nóng)業(yè)科學院培育品種?；蚪MDNA提取采用CTAB法進行[8]，選取2～3張嫩葉，加入1～2勺的PVP和液氮，迅速研磨成粉狀，移入1.5 mL的離心管后加入600 μL預熱至65 ℃的2% CTAB Buffer和7 μL β-巰基乙醇，充分混勻后，65 ℃ 水浴1 h，期間多次搖勻;室溫冷卻后三氯甲烷等體積的加入三氯甲烷/異戊醇，混勻靜置10 min，在 12 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min;取上清液，加入100 μL 3 mol/L NaAc和300 μL的三氯甲烷/異戊醇充分混勻，離心10 min;再次取上清液，并加入0.6倍體積異丙醇，混勻至能看到白色絮狀物，在 12 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，75%乙醇洗滌DNA 2～3次，風干后的DNA溶于100 μL TE溶液，加入2.5 μL RNase A去除RNA，保存于4 ℃或 -20 ℃ 備用。

1.3?普通絲瓜雜交種絲盛2號純度鑒定SSR特異引物的篩選

以絲盛2號雜交種及其父母本為模板，利用“1.1”節(jié)篩選的引物，進行PCR擴增，篩選能區(qū)分絲盛2號雜交種及其父母本的特異性引物。

PCR擴增時采用的反應體系：75 ng基因組DNA 1 μL，0.2 mmol/L dNTP 1 μL，500 u Taq DNA聚合酶0.3 μL，0.4 μmol/L的引物各1 μL，2.5 μL 10×Buffer，加入滅菌的超純水至25 μL。PCR擴增程序：先在95 ℃預變性5 min;接下來35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94 ℃下變性30 s，56 ℃下退火30 s，72 ℃ 下延伸30 min;最后72 ℃下延伸7 min，反應結(jié)束后于4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物電泳分離后觀察拍照分析。

1.4?普通絲瓜雜交種絲盛2號純度鑒定

隨機抽取絲盛2號雜交種，利用篩選出來的SSR特異引物進行鑒定，結(jié)合田間種植鑒定結(jié)果，驗證利用SSR分子標記鑒定種子純度的準確性。只有同時具有親本特異性條帶的單株才為真正的雜交種，缺少其中的任意一條帶記為假雜種，計算種子純度。

2?結(jié)果與分析

2.1?普通絲瓜DNA提取與鑒定

應用改良后CTAB法提取的DNA，通過濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結(jié)果表明：DNA條帶清晰，拖帶現(xiàn)象不明顯，帶形集中。D260 nm/D280 nm值在1.8～2.0之間，表示所提取的DNA雜質(zhì)含量少，純度較高，適合于做進一步研究（圖1）。

2.2?普通絲瓜SSR分子標記數(shù)據(jù)來源與篩選

普通絲瓜轉(zhuǎn)錄組經(jīng)組裝后共獲得58 073條Unigene，利用MISA工具進行搜索，其中6 916條Unigene序列中含有7 478個SSR位點。對含SSR位點的6 916條Unigene序列利用Primer 3.0設(shè)計引物，共設(shè)計出SSR引物7 563對。選取長度在 20 bp 以上的SSR序列，合成長度18～25 bp、擴增產(chǎn)物長度100～280 bp的引物150對，進行SSR-PCR擴增有效性檢測。SSR-PCR擴增結(jié)果表明，106對SSR引物實現(xiàn)有效擴增，且?guī)颓逦?、重復性好（圖2）。

2.3?SSR特異引物篩選

利用篩選出的106對有效擴增SSR引物對絲盛2號雜交種及其父母本進行PCR擴增及特異引物篩選。篩選到共顯性標記的引物SGSSR4

（SGSSR4-F：5′-AGGGGTTAGTCGACCGATTT-3′;SGSSR4-R：5′-TGCTTGCCACTTGAAGAAAC-3′）。引物SGSSR4能同時產(chǎn)生父本和母本特異性標記，并在絲盛2號雜交種中擴增出互補條帶（圖3），表明該對引物可用于絲盛2號種子純度的檢測。

2.3?雜交種純度鑒定

從田間隨機選取26株絲盛2號普通絲瓜，利用篩選得到的特異性引物對SGSSR4進行純度檢測，PCR擴增結(jié)果表明，25株能清晰地擴增出與親本互補的條帶，擴增出父本特異條帶各1株（圖4），種子純度為96.15%，與田間檢測結(jié)果一致。

3?討論與結(jié)論

近些年隨著分子標記技術(shù)的深入研究，使得分子標記技術(shù)成為鑒定普通絲瓜種子純度的快速、準確的方法?；谵D(zhuǎn)錄組的SSR分子標記較一般的分子標記具有信息量大、通用性好、在基因組序列中分布廣泛等優(yōu)勢，在雜交種的鑒定和種子純度檢測方面具有很大優(yōu)越性，已在多種植物中廣泛應用[9-10]?，F(xiàn)有的普通絲瓜SSR分子標記數(shù)量有限，

大量開發(fā)SSR標記仍是目前普通絲瓜研究的重要工作之一。本研究利用普通絲瓜轉(zhuǎn)錄組測序獲得的SSR標記，篩選出能有效擴增，且?guī)颓逦?、重復性好的SSR引物，為后期普通絲瓜雜交種子純度鑒定提供了參考。

鑒于采用傳統(tǒng)的田間性狀鑒定技術(shù)鑒定種子純度周期長、成本高、工作量大，且以播種后植株的田間形態(tài)觀察為依據(jù)，易受外界環(huán)境和檢測人員水平等因素影響，導致結(jié)果存在偏差[11]。SSR分子標記技術(shù)直接反映不同品種的遺傳基礎(chǔ)差異，為植物品種種子純度鑒定提供了一種更準確、快速、簡便、高效的方法。SSR標記數(shù)量多，具有很高多態(tài)性，帶型易于區(qū)分判斷，能區(qū)分純合基因型和雜合基因型，是一項很有潛力的技術(shù)，在黃瓜[12]、青花菜[13]、甘藍[14]等蔬菜中都有相關(guān)報道，但是利用SSR分子標記技術(shù)鑒定品種種子純度時，前提條件是能夠準確篩選出能在雙親中清晰、特異擴增的條帶。本研究從106對引物中篩選出1條特異性強的引物SGSSR4，引物SGSSR4能同時產(chǎn)生父本和母本特異性標記，可將普通絲瓜雜交種子與其父母本區(qū)分開來，快速檢測出雜交種子的純度，具有準確、低成本、操作方便等優(yōu)勢，能夠代替?zhèn)鹘y(tǒng)雜交種子純度鑒定的方法，具有較高的商業(yè)應用價值，為普通絲瓜種子質(zhì)量控制和純度鑒定提供了參考依據(jù)。

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