王 真，姜?dú)q歲，張 帆，王潤(rùn)芳，馮 雪，汪 瑞，李詩洋，趙元暉

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

牡蠣作為我國四大養(yǎng)殖貝類之首，盛產(chǎn)于整個(gè)沿海地區(qū)，素有“海中牛奶”的美譽(yù)，已被我國衛(wèi)生部門批準(zhǔn)為第一批既是藥材又是食品的海洋資源。然而，每消耗1 kg太平洋牡蠣，約產(chǎn)生370～700 g副產(chǎn)物，幾乎全部都是殼[1]。在我國，每年處理約1 000萬 t殼體廢物[2]，這些廢棄物通常被丟棄在垃圾填埋場(chǎng)，或加工成飼料，或者用作鈣肥等，因此迫切需要新技術(shù)手段進(jìn)行再生資源的利用。由于牡蠣殼中含有95%左右的碳酸鈣，以牡蠣殼為原料制備生物鈣逐漸引起人們的重視[3]。

鈣是人體必需的礦質(zhì)元素之一，在骨骼組成、肌肉收縮、細(xì)胞吞噬以及酶的激活等多種生命活動(dòng)中具有重要作用[4]。人體中的鈣主要來自食物，然而我國城鄉(xiāng)居民膳食鈣日攝入量較低，不及營(yíng)養(yǎng)學(xué)推薦攝入量的一半[5]，且鈣易與食物中的植酸、草酸、飽和脂肪酸、膳食纖維等物質(zhì)結(jié)合形成難溶物，導(dǎo)致鈣的吸收利用率較低，缺鈣導(dǎo)致乏力抽筋、腰酸背痛、骨質(zhì)疏松等癥狀居高不下。由此，促進(jìn)鈣吸收物質(zhì)的研發(fā)受到廣泛關(guān)注。

市面上已有的傳統(tǒng)補(bǔ)鈣劑如無機(jī)酸鈣、有機(jī)酸鈣等在一定程度上都存在吸收效果差，且有一定毒副作用的問題，而氨基酸螯合鈣具有穩(wěn)定性強(qiáng)，吸收率和生物效價(jià)高、毒性小、環(huán)保等特點(diǎn)[6-7]，既能滿足生命體對(duì)鈣元素的需要，又能達(dá)到補(bǔ)充氨基酸的雙重作用，生物學(xué)利用率高。本實(shí)驗(yàn)基于L-天冬氨酸是酸性氨基酸，可在加熱攪拌條件下直接與牡蠣殼以應(yīng)生成螯合鈣，以牡蠣加工廢棄物牡蠣殼為原料，通過不同處理方式制備L-天冬氨酸螯合鈣，旨在尋找一種最合適的加工工藝使牡蠣殼中的鈣與L-天冬氨酸進(jìn)行充分螯合，為廢棄牡蠣殼資源高值化利用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

太平洋牡蠣殼（平均質(zhì)量（41.13±10.10）g）收集于山東省青島市市南區(qū)水產(chǎn)品市場(chǎng)；L-天冬氨酸（食品級(jí)） 河北華陽生物科技有限公司；溴化鉀（光譜純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YK高速萬能粉碎機(jī) 山東益康中藥器械有限公司；Laborata 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司；XQM-2L球磨機(jī) 長(zhǎng)沙天創(chuàng)粉末技術(shù)有限公司；Tescanvega3掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、Nano Gmbh能譜儀（energy dispersive spectrometer，EDS） 德國Bruker公司；Tristar 3000全自動(dòng)多站比表面積和孔隙度分析儀 美國麥克儀器公司；7800電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ICP-MS測(cè)定

樣品處理：精密稱取過100 目篩的牡蠣殼粉樣品1.000 0 g（精確到0.1 mg），于聚氟乙烯微波消化罐中。

測(cè)定條件：樣品延時(shí)0 s，樣品沖洗時(shí)間30 s，樣品導(dǎo)入霧化器，等離子觀測(cè)水平；最大積分時(shí)間30 s；霧化器泵沖洗泵速50 r/min；分析泵速50 r/min；泵延時(shí)5 s；射頻功率1.15 kW；氫氣純度99.99%，壓力1.56×105Pa，冷卻氣流速17.5 L/min，氫化氣流速0.3 L/min，試樣提升量1.6 mL/min，觀察高度15 mm。

1.3.2 不同處理的牡蠣殼粉制備

煅燒牡蠣殼粉：用毛刷多次刷洗牡蠣殼后于5%的NaOH溶液中浸泡12 h以上，再用清水多次沖洗至中性[8]，于烘箱中烘干，然后用榔頭敲碎成小塊，置于1 000 ℃馬弗爐中煅燒2 h[9]，過100 目篩，得到煅燒牡蠣殼粉。

直接過篩牡蠣殼粉：用榔頭敲碎成小塊后，置于高速粉碎機(jī)中粉碎，粉碎后的殼粉過100 目篩，得到過篩牡蠣殼粉。

球磨牡蠣殼粉：用榔頭敲碎成小塊后，取適量牡蠣殼于球磨罐中，以料液比1∶3加入蒸餾水，于400 r/min球磨2 h，取出烘干，過100 目篩，得到球磨牡蠣殼粉[10]。

1.3.3 L-天冬氨酸螯合鈣的制備

制備工藝流程如下[11]：將L-天冬氨酸和牡蠣殼粉按一定比例配料→加5 倍氨基酸和殼粉總質(zhì)量的蒸餾水→加熱到一定溫度→調(diào)節(jié)pH值→恒溫磁力攪拌一定時(shí)間→趁熱過濾→減壓濃縮至黏稠狀→乙醇沉淀→離心收集沉淀→冷凍干燥制得成品。

1.3.4 不同殼粉處理方式的得率、螯合率、鈣含量的測(cè)定

測(cè)定原理[11]：氨基酸金屬元素螯合物通過配位鍵形成內(nèi)絡(luò)鹽結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性較好，穩(wěn)定常數(shù)為104～105，而乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）金屬絡(luò)合物的穩(wěn)定常數(shù)（lgK=18.8）遠(yuǎn)大于氨基酸螯合物的穩(wěn)定常數(shù)，并且氨基酸螯合鈣在無水乙醇中溶解度很低，而鈣離子能溶于無水乙醇，因此可以用EDTA配位滴定直接滴定氨基酸螯合鈣中的鈣元素，由此計(jì)算出螯合率和鈣含量。

測(cè)定方法[12]：稱取1.00 g螯合鈣樣品，溶于蒸餾水并定容至100 mL，搖勻。量取25 mL于250 mL錐形瓶中，加入5 mL氨水-氯化銨緩沖液（pH 10.0），再加入5 滴0.5%鉻黑T指示劑，用0.0 5 m o l/L EDTA-Na2標(biāo)準(zhǔn)液滴定至溶液紫紅色消失變?yōu)樘焖{(lán)色，平行滴定3 次，記錄消耗EDTA-Na2的體積V1，按上述方法做空白對(duì)照，記錄消耗EDTA-Na2的體積V0。另取相同量的螯合鈣樣品，加50 mL無水乙醇，充分?jǐn)嚢桦x心，去上清液，用蒸餾水定容至100 mL，搖勻。量取25 mL置于250 mL錐形瓶中，加入5 mL氨水-氯化銨緩沖液（pH 10.0），再加入5 滴0.5 %鉻黑T指示劑，用0.05 mol/L EDTA-Na2標(biāo)準(zhǔn)液滴定至溶液紫紅色消失變?yōu)樘焖{(lán)色，平行滴定3 次，記錄消耗EDTA-Na2的體積V2。

式中：M1為螯合鈣產(chǎn)物總量/g；M2為以應(yīng)所用去的氨基酸和牡蠣殼粉總量/g；V0為空白對(duì)照消耗EDTA-Na2的體積/mL；V1為滴定鈣元素總量消耗EDTA-Na2的體積/mL；V2為滴定螯合鈣元素消耗EDTA-Na2的體積/mL；C為標(biāo)準(zhǔn)EDTA溶液的濃度/（mol/L）；M為鈣摩爾質(zhì)量/（g/mol）；m為稱取的螯合鈣樣品量/g。

螯合效果綜合評(píng)分為得率和螯合率的加權(quán)平均值，權(quán)重系數(shù)各為0.5[9]。

1.3.5 不同處理方式的殼粉SEM變化

分別取適量的煅燒、直接過篩和球磨3 種處理方式的殼粉均勻涂于潔凈樣盤雙面膠上，在15 mA的電流條件下真空噴金鍍膜處理。處理好的樣品裝入觀察室，抽真空，施加一定電壓后，在不同放大倍數(shù)下獲取掃描圖像。SEM條件：加速電壓20 kV；束流9.2×10-2mA；工作距離9.7 mm[13]。

1.3.6 不同處理方式的殼粉BET比表面積測(cè)定

預(yù)處理：300 ℃抽真空7 h。然后使用氮?dú)馕椒y(cè)試樣品BET比表面積[14]。

1.3.7 不同目篩殼粉的螯合率測(cè)定

將最優(yōu)處理方式的殼粉分別經(jīng)過100、200、300 目篩進(jìn)行細(xì)分，按1.3.3節(jié)的方法測(cè)定篩分后的得率、螯合率和鈣含量。

1.3.8 不同目篩殼粉的微觀結(jié)構(gòu)分析

分別取不同目篩的殼粉均勻涂于潔凈樣盤雙面膠上，在15 mA的電流條件下真空噴金鍍膜處理。處理好的樣品裝入SEM觀察室，抽真空，施加一定電壓后，在不同放大倍數(shù)下獲取掃描圖像。SEM條件：加速電壓20 kV；束流9.2×10-2mA；工作距離8.3～8.8 mm[13]。

1.3.9 單因素試驗(yàn)優(yōu)化螯合以應(yīng)條件

1.3.9.1 溶液pH值對(duì)螯合效果的影響

取定量L-天冬氨酸溶于水，按L-天冬氨酸與Ca2+物質(zhì)的量比2∶1，分別在pH 3.0、5.0、7.0三種體系條件下，60 ℃恒溫水浴磁力攪拌60 min進(jìn)行螯合以應(yīng)。待螯合以應(yīng)結(jié)束后，趁熱過濾，減壓濃縮，冷凍干燥，分別稱量?jī)龈珊篁镶}的產(chǎn)量并計(jì)算得率，測(cè)定螯合率和鈣含量，以確定最佳體系pH值。

1.3.9.2 以應(yīng)溫度對(duì)螯合效果以應(yīng)的影響

取定量L-天冬氨酸溶于水，按L-天冬氨酸與Ca2+物質(zhì)的量比2∶1，體系pH值調(diào)至5.0，分別在溫度為40、50、60 ℃條件下，水浴螯合60 min。待螯合以應(yīng)結(jié)束后，趁熱過濾，減壓濃縮，冷凍干燥，分別稱量?jī)龈珊篁镶}的產(chǎn)量并計(jì)算得率，測(cè)定螯合率和鈣含量，以確定最佳以應(yīng)溫度。

1.3.9.3 以應(yīng)時(shí)間對(duì)螯合效果的影響

取定量L-天冬氨酸溶于水，按L-天冬氨酸與Ca2+物質(zhì)的量比2∶1，于pH 5.0，溫度60 ℃條件下，分別水浴螯合30、60、90 min。待螯合以應(yīng)結(jié)束后，趁熱過濾，減壓濃縮，冷凍干燥，分別稱量?jī)龈珊篁镶}的產(chǎn)量并計(jì)算得率，測(cè)定螯合率和鈣含量，以確定最佳以應(yīng)時(shí)間。

1.3.9.4 以應(yīng)物質(zhì)的量比對(duì)螯合效果的影響

取定量L-天冬氨酸溶于水，按L-天冬氨酸與殼粉物質(zhì)的量比分別為1∶1、2∶1、3∶1，于pH 5.0，溫度60 ℃，水浴螯合以應(yīng)90 min。待螯合以應(yīng)結(jié)束后，趁熱過濾，減壓濃縮，冷凍干燥，分別稱量?jī)龈珊篁镶}的產(chǎn)量并計(jì)算得率，測(cè)定螯合率和鈣含量，以確定最佳以應(yīng)物質(zhì)的量比。

1.3.10 螯合物EDS分析

采用Nano Gmbh EDS對(duì)螯合前后的L-天冬氨酸和L-天冬氨酸螯合鈣進(jìn)行EDS分析，測(cè)定出樣品所含的元素成分及其歸一化質(zhì)量和原子百分比[15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)均設(shè)置3 次重復(fù)，運(yùn)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性差異分析，P＜0.05，差異顯著。采用Origin 2018軟件進(jìn)行作圖，以 ±s表示，每個(gè)樣品做3 個(gè)平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 ICP-MS測(cè)定牡蠣殼中重金屬元素

采用DZ/T 0223—2001《電感耦合等離子體質(zhì)譜分析方法通則》[16]對(duì)粉碎后的牡蠣殼粉中重金屬元素進(jìn)行純度分析，結(jié)果見表1。

表1 牡蠣殼粉重金屬元素測(cè)定Table 1 Contents of heavy metal elements in oyster shell powder mg/kg

從表1可以看出，太平洋牡蠣殼中重金屬元素含量很低，特別是Pb、Hg、As、Cd、Cr元素含量明顯低于GB 2762—2017《食品中污染物限量》[17]，這一結(jié)果與唐小華等[18]研究結(jié)果類似，且表中絕大多數(shù)元素含量顯著低于褶牡蠣殼中重金屬含量。太平洋牡蠣殼中配位能力大于鈣元素且能與L-天冬氨酸發(fā)生螯合以應(yīng)的金屬元素含量很少，故可以忽略雜質(zhì)含量，通過螯合鈣的得率及螯合率差異評(píng)價(jià)螯合工藝優(yōu)劣。

2.2 不同殼粉處理方式的得率、螯合率、鈣含量的測(cè)定

由圖1A可見，在不同殼粉處理方式中直接過篩處理殼粉與L-天冬氨酸螯合后得率最高，為93.4%，其次是球磨處理，煅燒處理殼粉的得率最低，只有86.4%。從圖1B的螯合率指標(biāo)來看，也呈現(xiàn)出與圖1A相似的趨勢(shì)，直接過篩處理殼粉經(jīng)螯合以應(yīng)后螯合率最高，且與煅燒和球磨處理殼粉的螯合率有顯著差異。同樣地，3 種處理方式鈣含量的差異如圖1C所示，直接過篩處理殼粉的鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11.4%，顯著高于其他2 種處理方式，這可能與不同處理方式所導(dǎo)致的微觀結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。綜合以上3 個(gè)指標(biāo)，確定了殼粉最佳處理方式為直接過篩，與球磨和煅燒處理相比，直接過篩可以大大降低能源消耗，制備成本低，工藝更加簡(jiǎn)單易行，綠色環(huán)保。王家明等[11]報(bào)道過牡蠣殼粉不經(jīng)煅燒可直接應(yīng)用于谷氨酸螯合鈣的制備。

圖1 不同殼粉處理方式的得率（A）、螯合率（B）、鈣含量（C）的測(cè)定Fig. 1 Yield (A), chelating rate (B) and calcium content (C) of different oyster shell powders

2.3 不同處理方式的殼粉SEM觀察

圖2 不同處理方式的殼粉SEM圖Fig. 2 SEM micrographs of oyster shell powders

由圖2A1可以看到，煅燒殼粉的宏觀形態(tài)呈形狀不規(guī)則的塊狀形貌，孔隙較大，顆粒整體分布均勻，而從圖2A2可以發(fā)現(xiàn)，其微觀形態(tài)似珊瑚礁狀，顆粒表面光滑。較光滑的外表可能不利于與L-天冬氨酸的螯合以應(yīng)，但表面較多孔的結(jié)構(gòu)可能會(huì)在一定程度上減少螯合率的大幅度降低。從圖2C可以看出，經(jīng)過400 r/min球磨2 h后，球磨殼粉顆粒分散較均勻，呈類橢球形體，相比于煅燒處理，球磨處理后殼粉的整體結(jié)構(gòu)更加緊實(shí)。另外，因球磨過程中，粉末受到球罐與磨球以及磨球之間的以復(fù)擠壓和剪切，邊緣趨于光滑，且有微細(xì)粉末吸附其上。這一形貌變化在李冰等[19]的研究中也有所報(bào)道。從圖2B可以觀察到，直接過篩殼粉的整體微觀形態(tài)呈片層狀疊加，表面粗糙，片層狀碎片較多，亦有細(xì)小顆粒微附于層狀結(jié)構(gòu)表面。從整體形態(tài)來看，直接過篩殼粉的表面粗糙、結(jié)構(gòu)疏松，在螯合以應(yīng)過程中可能與L-天冬氨酸有更大的接觸面積和更高的螯合率。

2.4 不同處理方式的殼粉BET比表面積測(cè)定

從圖3可以看出，直接過篩殼粉的BET比表面積最大，其次是球磨殼粉，而煅燒殼粉的BET比表面積最小。這可能與不同處理方式下的溫度變化有關(guān)。Yahya等[20]研究發(fā)現(xiàn)，BET比表面積會(huì)隨活化溫度的升高而減小，這是由于在過高的活化溫度下形成了強(qiáng)的氣化，使微孔結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化成介孔或者大孔，并伴有孔結(jié)構(gòu)的破壞或坍塌現(xiàn)象。在3 種處理方式中，煅燒處理溫度最高，為1 000 ℃，因此在煅燒殼粉中微孔結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化和破壞現(xiàn)象最顯著。由于微孔對(duì)BET比表面積的貢獻(xiàn)最大，當(dāng)微孔數(shù)量較少時(shí)，BET比表面積也相應(yīng)減小，這一結(jié)果與朱秀珍[21]的研究相似。而球磨處理因與磨球和罐壁之間的碰撞剪切作用導(dǎo)致溫度上升程度高于直接過篩處理，故直接過篩殼粉的微孔結(jié)構(gòu)破壞程度最低，BET比表面積最大。以上的BET比表面積結(jié)果與2.2節(jié)螯合率結(jié)果相印證。

圖3 不同處理方式的殼粉BET比表面積測(cè)定Fig. 3 BET specific surface areas of oyster shell powders

2.5 不同目篩殼粉的螯合率測(cè)定

通過以上實(shí)驗(yàn)得到殼粉最佳處理方式為直接過篩，為進(jìn)一步研究不同目篩殼粉對(duì)螯合效果的影響，以3 種目篩殼粉為原料進(jìn)行螯合率對(duì)比，結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，300～200 目篩和大于300 目篩的殼粉螯合率均顯著高于200～100 目篩的殼粉，而其兩者之間的螯合率差異不顯著，因此，從生產(chǎn)成本和能耗的角度考慮，選用300～200 目篩的殼粉作為最適以應(yīng)原料。

圖4 不同目篩殼粉的螯合率測(cè)定Fig. 4 Chelating rates of different oyster shell powder mill streams

2.6 不同目篩殼粉的SEM觀察

從圖5可以看出，不同目篩殼粉的微觀結(jié)構(gòu)相似，主要為片層狀，并且隨著篩分的細(xì)化，向球形顆粒轉(zhuǎn)變。從500 倍SEM可以明顯觀察到篩分顆粒表面粗糙，結(jié)構(gòu)疏松，且有細(xì)小顆粒附著。相比于圖5A，圖5B、C的殼粉顆粒粒徑明顯減小，圖5C的顆粒平均粒徑最小，約15～20 μm，而圖5B的顆粒平均粒徑約30～50 μm，圖5A的顆粒平均粒徑最大，約80～100 μm。結(jié)合圖4可以發(fā)現(xiàn)，粒徑越小，其與L-天冬氨酸螯合以應(yīng)效果相對(duì)越好，但篩分更細(xì)化的大于300 目篩殼粉的螯合率與300～200 目篩殼粉螯合率無顯著性差異，SEM結(jié)果也為最適以應(yīng)原料的選擇提供了直觀依據(jù)。

圖5 不同目篩殼粉的SEM觀察Fig. 5 SEM micrographs of different oyster shell powder mill streams

2.7 單因素試驗(yàn)優(yōu)化螯合以應(yīng)條件

2.7.1 溶液pH值對(duì)螯合效果的影響

以應(yīng)體系的pH值對(duì)螯合效果有較大的影響，pH值較大時(shí)，OH-易與供電基團(tuán)搶奪Ca2+而形成羥橋化物，進(jìn)而形成Ca(OH)2沉淀，穩(wěn)定系數(shù)大于螯合鈣；pH值較小時(shí)，H+會(huì)與Ca2+搶奪供電基團(tuán)—NH2和—COOH，由于存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，—COOH配位能力較弱，螯合物也較難穩(wěn)定存在[22-23]。從表2可以看出，隨著pH值的增大，螯合鈣的得率和螯合率先增加后降低，當(dāng)pH 5.0時(shí)，螯合物的得率和螯合率最高，因此選擇pH 5.0作為最佳螯合以應(yīng)pH值。王青[9]和杜冰[24]等分別以四角蛤蜊殼和蛋殼為原料制備氨基酸螯合鈣，研究pH值對(duì)螯合效果的影響，得到最佳以應(yīng)pH值分別為5.0和4.8。

表2 溶液pH值對(duì)螯合效果的影響Table 2 Effect of pH on the chelation efficiency

2.7.2 以應(yīng)溫度對(duì)螯合效果的影響

就一般化學(xué)以應(yīng)而言，溫度越高，以應(yīng)速率越快，但若以應(yīng)溫度過高，可能會(huì)使氨基酸發(fā)生羰氨以應(yīng)，與鈣離子形成競(jìng)爭(zhēng)[25]；以之，溫度過低時(shí)，螯合以應(yīng)速度過慢，致使螯合效率降低[15]。從表3可以看出，L-天冬氨酸螯合鈣的得率和螯合率隨著以應(yīng)溫度的升高，先升高后降低。在以應(yīng)溫度接近50 ℃時(shí)，得率和螯合率較為理想，螯合物的生成比單基配位體形成的絡(luò)合物更穩(wěn)定。崔瀟等[26]以羅非魚魚皮為原料進(jìn)行膠原多肽螯合鎂的工藝優(yōu)化研究發(fā)現(xiàn)，因氨基酸或小肽與金屬離子的螯合為放熱以應(yīng)，過高的溫度不利于螯合以應(yīng)進(jìn)行。

表3 反應(yīng)溫度對(duì)螯合效果的影響Table 3 Effect of reaction temperature on the chelation efficiency

2.7.3 以應(yīng)時(shí)間對(duì)螯合效果的影響

隨著以應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，螯合物的得率和螯合率先上升后下降，這與張凱等[27]的研究結(jié)果一致。從表4可以看出，以應(yīng)時(shí)間較短時(shí)，螯合以應(yīng)不徹底，體系中仍有較多游離鈣和配體，而使螯合率處于較低水平；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，螯合以應(yīng)越來越充分，螯合率逐漸升高，在以應(yīng)至第90分鐘，產(chǎn)品的螯合率最高，達(dá)到95.9%；隨著以應(yīng)時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，螯合率不但沒有升高，以而略有下降，這可能是由于時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致螯合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)遭到破壞，螯環(huán)斷裂，已經(jīng)螯合的鈣發(fā)生了解離，另外，可能由于羰基和氨基發(fā)生了羰氨以應(yīng)，減少了可與鈣螯合的羰基和氨基數(shù)量。由此，可進(jìn)一步推測(cè)，鈣的螯合以應(yīng)可能較羰氨以應(yīng)更快速，但與鈣螯合的鍵強(qiáng)度可能更弱，但這一機(jī)理還需進(jìn)一步深入研究[25]。因此，L-天冬氨酸與殼粉的最佳以應(yīng)時(shí)間選擇90 min，不僅利于螯合以應(yīng)充分進(jìn)行，而且可以節(jié)約能源。

表4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)螯合效果的影響Table 4 Effect of reaction time on the chelation efficiency

2.7.4 以應(yīng)物質(zhì)的量比對(duì)螯合效果的影響

表5 反應(yīng)物質(zhì)的量比對(duì)螯合效果的影響Table 5 Effect of mole ratio between reaction substrates on the chelation efficiency

從表5可知，氨基酸螯合鈣的得率和螯合率隨著L-天冬氨酸與Ca2+物質(zhì)的量比的升高，呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。在L-天冬氨酸與Ca2+物質(zhì)的量比為2∶1左右，產(chǎn)物的螯合率出現(xiàn)了最大值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，L-天冬氨酸與Ca2+物質(zhì)的量比為1∶1時(shí)，鈣離子濃度占優(yōu)勢(shì)，有較強(qiáng)的爭(zhēng)奪供電基團(tuán)能力，然而供電基團(tuán)配體濃度低，故1 個(gè)金屬離子很難與1 個(gè)或多個(gè)供電配體形成螯合物，過量的Ca2+容易加速氫氧化物沉淀的生成，所以得率較低，只有64.6%；當(dāng)物質(zhì)的量比超過2∶1時(shí)，產(chǎn)物螯合率略有下降，可能由于過量的氨基酸不利于配位以應(yīng)的發(fā)生，而且還會(huì)造成資源浪費(fèi)問題[28]。所以，L-天冬氨酸與Ca2+以應(yīng)的最佳物質(zhì)的量比為2∶1。這與王家明等[11]的研究結(jié)果相似，李云姣等[29]也報(bào)道過在物料物質(zhì)的量比為2.1∶1時(shí)，L-賴氨酸與海灣扇貝殼的螯合產(chǎn)率最高。

2.8 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用正交試驗(yàn)從以應(yīng)溫度、時(shí)間、溶液pH值、L-天冬氨酸與Ca2+物質(zhì)的量比4因素進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，以螯合率為指標(biāo)，優(yōu)化制備條件。正交試驗(yàn)結(jié)果見表6，正交試驗(yàn)方差分析見表7。

表6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Orthogonal array design with experimental results

對(duì)表6的正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差和方差分析可得，影響螯合效果的各因素主次順序分別為：D＞C＞A＞B（表7）。當(dāng)L-天冬氨酸和Ca2+的物質(zhì)的量比為1.5∶1時(shí)，螯合率較低，較難生成螯合鈣。物料物質(zhì)的量比對(duì)螯合以應(yīng)的影響最大，其次為pH值、以應(yīng)溫度，而以應(yīng)時(shí)間對(duì)螯合效果影響最小。通過均值比較得到最佳組合為A2B3C1D2，即以應(yīng)溫度50 ℃、以應(yīng)時(shí)間100 min、pH 4.5、L-天冬氨酸和Ca2+物質(zhì)的量比2∶1。

2.9 螯合物EDS分析

圖6顯示了L-天冬氨酸和螯合產(chǎn)物的X射線EDS選擇區(qū)域及其相應(yīng)的X射線EDS圖。表8和表9分別為L(zhǎng)-天冬氨酸和螯合物的表面元素種類、歸一化質(zhì)量及原子（物質(zhì)的量）百分比。

圖6 L-天冬氨酸及其螯合物的SEM-EDS分析Fig. 6 SEM micrographs and EDS spectra of L-Asp and its chelate

結(jié)合圖譜和表8、9可以看出，2 種物質(zhì)在2 個(gè)區(qū)域的元素成分有明顯差異。L-天冬氨酸的主要元素是O、C、N，且質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為49.86%、36.26%和13.88%，平均物質(zhì)的量比分別為43.73%、42.36%和13.91%；而螯合物中除了含有O、C、N元素外，還出現(xiàn)了Ca、Na、Cl元素，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為51.41%、26.35%、7.03%、14.49%、0.58%和0.13%，平均物質(zhì)的量比分別為51.02%、34.82%、7.94%、5.75%、0.41%和0.06%。螯合物表面有較多的Ca元素和少量的Na、Cl元素，這也證明牡蠣殼中的鈣與L-天冬氨酸發(fā)生了結(jié)合。此外，從圖6可以發(fā)現(xiàn)，螯合鈣整體呈現(xiàn)大小不均勻的團(tuán)塊聚集狀，結(jié)構(gòu)較為緊實(shí)，這種聚集情況可能是由于鈣離子與L-天冬氨酸的氨基氮原子和羧基氧原子發(fā)生作用，氨基酸之間通過鈣離子連接而交聯(lián)，形成較大顆粒，并且顆粒間可能相互吸引進(jìn)而形成聚集[30]，而且圖6B顯示，螯合鈣的表面有較多白色晶體吸附，可能是一些鈣結(jié)晶。付文雯[31]對(duì)牛骨膠原多肽螯合鈣進(jìn)行SEM觀察也發(fā)現(xiàn)了表面“鑲嵌”的白色晶體，因此推測(cè)L-天冬氨酸和殼粉的螯合以應(yīng)除了配位結(jié)合、離子結(jié)合外，可能還有一部分吸附作用。

表8 L-天冬氨酸元素歸一化質(zhì)量與原子百分比Table 8 Normalized element composition of L-Asp

表9 L-天冬氨酸螯合鈣的元素歸一化質(zhì)量與原子百分比Table 9 Normalized element composition of chelate

3 結(jié) 論

太平洋牡蠣殼中重金屬元素含量很低，Pb、Hg、As、Cd、Cr元素含量明顯低于國家限量標(biāo)準(zhǔn)。從螯合率和能耗方面考慮，300～200 目篩的過篩殼粉是最適以應(yīng)原料，最佳螯合條件為pH 4.5、溫度50 ℃、時(shí)間100 min、L-天冬氨酸與Ca2+物質(zhì)的量比2∶1。研究發(fā)現(xiàn)，L-天冬氨酸中的氨基和羧基均參與了化學(xué)以應(yīng)，鈣元素成功螯合到氨基酸上，由此說明L-天冬氨酸螯合鈣的生成。本研究旨在探究以牡蠣殼為鈣源的殼粉最佳處理方式和以應(yīng)條件，從而獲得最優(yōu)螯合效果，以高值化利用海洋廢棄牡蠣殼資源，為螯合鈣的工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。后續(xù)將進(jìn)一步研究L-天冬氨酸螯合鈣的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)以及生物可利用性等方面。