盛華棟，潘項捷，張水鋒，劉敏芳，施元旭，王璐璐，陸文琪

（浙江方圓檢測集團(tuán)股份有限公司，浙江 杭州 310018）

高氯酸鹽是一種環(huán)境持久污染物，理化性質(zhì)穩(wěn)定，易溶于水，能污染地下水，并出現(xiàn)在土壤和食物中[1-2]。高氯酸鹽能競爭性抑制甲狀腺對碘的攝入，導(dǎo)致甲狀腺功能紊亂，影響人體正常的新陳代謝和生長發(fā)育[3]。近年來，食品中高氯酸鹽的污染受到人們廣泛關(guān)注，奶類[4]、茶葉[5-7]、飲用水[8-9]、水果[10]和蔬菜[11]等均檢出不同濃度的高氯酸鹽。氯酸鹽是飲用水二氧化氯消毒產(chǎn)生的副產(chǎn)物，同樣能影響人體的甲狀腺系統(tǒng)和血液系統(tǒng)[12]。歐洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）檢測發(fā)現(xiàn)冷凍食品中氯酸鹽的含量較高，果蔬污染最嚴(yán)重[13]。溴酸鹽是一種面粉改良劑，同時也普遍存在經(jīng)臭氧消毒的飲用水中[14]。溴酸鹽被證明對人體腎臟有害，被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)認(rèn)定為2B級致癌物[15]。GB/T 5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定氯酸鹽的限量為0.7 mg/L，溴酸鹽的限量為0.01 mg/L。

目前食品中有關(guān)高氯酸鹽、氯酸鹽和溴酸鹽的檢測常見的方法主要有離子色譜（ion chromatography，IC）法[16-18]、電感耦合等離子質(zhì)譜（inductively coupled plasmamass spectrometry，ICP-MS）法[19-20]、離子色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ion chromatography-tandem mass spectrometry，IC-MS/MS）法[21-22]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[23-25]等。IC法受基質(zhì)干擾影響較大，ICP-MS法易受復(fù)雜基質(zhì)中陽離子或陰離子的干擾，質(zhì)譜檢測器容易被污染[26]。IC-MS/MS法靈敏度高，抗干擾能力強(qiáng)，但設(shè)備普及率不高，不利于方法的推廣和應(yīng)用。LC-MS/MS法靈敏度高，能夠在較短時間內(nèi)完成多種物質(zhì)的分析，抗基質(zhì)干擾能力強(qiáng)。本研究采用改良的QuEChERS前處理方法，建立同時測定果蔬中高氯酸鹽、氯酸鹽和溴酸鹽的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）檢測方法，該方法穩(wěn)定、分析周期短，能同時測定3 種有害的無機(jī)陰離子，為果蔬中有害無機(jī)陰離子的檢測提供有效的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

溴酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 mg/L） 中國計量科學(xué)研究院；高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 mg/L） 美國O2si公司；氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 mg/L） 美國Inorganic Ventures公司；N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、C18深圳逗點生物技術(shù)有限公司；石墨化碳黑（graphitizing of carbon black，GCB）（120-400MESH）德國CNW Technologies公司；實驗用水均為符合GB/T 6682—2008《分析實驗室用水國家標(biāo)準(zhǔn)》的實驗室一級用水；乙腈（色譜純） 德國Merck公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Triple Quad 5500三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源） 美國AB SCIEX公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司；ST16R高速冷凍離心機(jī)美國Thermos公司；HY-2A調(diào)速振蕩器 江蘇金壇榮華有限公司；VG3 S025渦旋混合器、T25高速勻漿機(jī)德國IKA公司；GM200刀式研磨儀 德國Retsch公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備和處理

新鮮的果蔬取其可食部分，用研磨儀制成勻漿備用。稱取處理好的樣品5 g（精確至0.01 g）至50 mL離心管中，加10 mL 50%乙腈溶液，渦旋1 min，超聲提取8 min，8 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液于25 mL容量瓶中，重復(fù)提取一次，合并上清液于25 mL容量瓶中，用乙腈定容至25 mL，搖勻，待凈化。取1.0 mL提取液于2.5 mL預(yù)先加有凈化劑（PSA、C18和GCB）的離心管中，渦旋1 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液，過0.22 μm濾膜，上機(jī)測定。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1.0 mg/L）的配制：準(zhǔn)確移取1 000 mg/L的高氯酸鹽、氯酸鹽和溴酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL于100 mL容量瓶，超純水定容，4 ℃保存，保質(zhì)期1 周。

空白基質(zhì)提取液：樣品按照1.3.1節(jié)條件進(jìn)行前處理后進(jìn)行儀器分析，當(dāng)3 種陰離子的定性與定量離子信噪比均小于3 時，樣品確定為空白基質(zhì)。空白基質(zhì)按照1.3.1節(jié)條件進(jìn)行前處理，獲得空白基質(zhì)提取液。

基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：采用逐級稀釋的方式將標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制成0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.3 UPLC-MS/MS條件

UPLC條件：色譜柱IC-PakTMAnion HR（4.6 mm×75 mm，6 μm），柱溫：40 ℃，進(jìn)樣量：5 μL。流動相A為乙腈，B為80 mmol/L乙酸銨；等度洗脫程序：0～7 min，A 60%+B 40%；流速：0.7 mL/min。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，負(fù)離子模式；離子源溫度450 ℃；霧化氣壓力60 psi；輔助氣壓力60 psi；氣簾氣壓力35 psi；掃描模式：多以應(yīng)監(jiān)測（multi reaction monitor，MRM）。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在3 種離子中都存在鹵族元素（Cl和Br），屬于強(qiáng)吸電子基團(tuán)，使得分子中的氫質(zhì)子極易失去形成負(fù)離子。分別配制100 μg/L的3 種陰離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用針泵進(jìn)樣模式，在電噴霧離子源，負(fù)離子模式下進(jìn)行Q1全掃描，能獲得3 種離子穩(wěn)定的分子離子峰[M-H]-。選擇溴酸鹽母離子（m/z126.9）、高氯酸鹽母離子（m/z99.0）、氯酸鹽母離子（m/z83.0），對每個母離子分別進(jìn)行二級碎片掃描，發(fā)現(xiàn)3 種離子都可以失去一個或兩個氧原子以形成相應(yīng)的片段，選取2 個響應(yīng)較高的碎片作為子離子，建立MRM離子對，分別優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，3 種離子的具體參數(shù)見表1。

表1 高氯酸鹽、氯酸鹽和溴酸鹽的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for detection of bromate,perchlorate and chlorate

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

比較Waters ACQUITY UPLC BEH C18和Agilent ZORBAX SB-Aq柱發(fā)現(xiàn)3 種離子出峰較快，保留時間為1.2 min左右，說明3 種離子在這兩種柱子中保留效果較差。實際樣品檢測時無法有效分離干擾峰。本方法使用IC-PakTMAnion HR色譜柱，為陰離子交換柱，適合分析強(qiáng)陰離子[27]。流動相選擇乙腈-乙酸銨溶液體系，實驗比較不同濃度的乙酸銨對3 種離子出峰時間和峰形的影響，乙酸銨濃度為5 mmol/L和20 mmol/L時，3 種離子無法洗脫；當(dāng)乙酸銨濃度增加到50 mmol/L時，出峰時間較晚，峰形較寬；當(dāng)乙酸銨濃度增加到80 mmol/L時，峰形較好、靈敏度較高，總離子流圖如圖1所示。最終選用80 mmol/L乙酸銨和乙腈作為流動相，流速為0.7 mL/min，7 min內(nèi)可完成分析，高氯酸鹽出峰時間為5.4 min，氯酸鹽出峰時間為4.6 min，溴酸鹽出峰時間為4.1 min。提取離子色譜圖如圖2所示。

圖1 使用50 mmol/L（A）和80 mmol/L（B）乙酸銨時總離子流圖Fig. 1 Total ion chromatograms at ammonium acetate concentrations of 50 (A) and 80 mmol/L (B) in mobile phase

圖2 高氯酸鹽（A）、氯酸鹽（B）和溴酸鹽（C）的提取離子色譜圖Fig. 2 Extracted ion chromatograms of perchlorate (A), chlorate (B)and bromate (C)

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 提取劑的優(yōu)化

QuEChERS法常用的提取溶劑是乙腈，乙腈極性范圍寬，組織穿透能力強(qiáng)，對脂肪、糖和蛋白質(zhì)類化合物提取率低[28]，同時3 種無機(jī)陰離子都有較好的水溶性。如圖3A所示，實驗以乙腈和水作為提取劑，以添加量為50 μg/kg的青菜基質(zhì)為例，比較25%、50%、75%乙腈溶液以及純乙腈、純水的提取效果。結(jié)果表明，乙腈比例超過50%時3 種離子的相對強(qiáng)度都較高。實驗結(jié)果表明純水提取時，提取液顏色較淺，說明胞內(nèi)組織液并沒有提取充分。綜合考慮選擇50%乙腈溶液作為提取溶劑，為保證提取效果，重復(fù)提取2 次。

圖3 提取劑中乙腈體積分?jǐn)?shù)（A）和超聲提取時間（B）對3 種陰離子提取效率的影響Fig. 3 Effects of acetonitrile concentration (A) and ultrasonic extraction time (B) on extraction efficiency of three anions

2.2.2 提取時間的優(yōu)化

采用超聲輔助提取法，超聲波獨有的物理特性，能促使植物組織破壁。實驗考察超聲提取5、8、10、15 min和20 min對提取效率的影響。結(jié)果表明，超聲8 min以后，3 種離子的相對強(qiáng)度都較高，因此超聲提取時間選擇8 min，結(jié)果見圖3B。

2.2.3 凈化材料的優(yōu)化

QuEChERS法常見的凈化吸附劑有PSA、GCB和C18。PSA作為弱陰離子交換吸附劑，能去除非極性樣品中的極性雜質(zhì)，如糖類、有機(jī)酸和色素等。GCB作為弱極性或非極性吸附劑，能有效去除色素、類胡蘿卜素和甾醇等非極性化合物[29]；C18可以吸附脂質(zhì)和脂類等非極性雜質(zhì)[30]。實驗考察3 種吸附劑的凈化效果，以添加量為50 μg/kg的青菜基質(zhì)為例，取1.0 mL按照1.3.1節(jié)方法處理后的提取液，分別加入PSA（50、100、150、200 mg）、GCB（20、30、40、50 mg）和C18（50、100、150、200 mg），計算回收率[31]。結(jié)果表明單一使用PSA時3 種離子的回收率較低，只有50.0%～65.0%，說明PSA在凈化樣品的同時對3 種陰離子都具有吸附作用，因此放棄使用。單一使用GCB用量從20 mg增加至50 mg時，3 種離子的回收率能顯著增加，當(dāng)GCB用量40 mg時3 種離子的回收率都能達(dá)到90%以上。單一使用C183 種離子的回收率也較高，當(dāng)C18用量從50 mg增加至200 mg時，回收率在75%～92%之間，回收率提升不明顯。考慮到果蔬基質(zhì)主要以脂類和色素為主，而GCB去除色素的效果較好，因此選擇GCB和C18聯(lián)合使用作為凈化吸附劑，當(dāng)GCB 40 mg和C18200 mg組合使用時3 種離子的回收率達(dá)到92%以上，滿足分析要求，結(jié)果如圖4所示。

圖4 凈化材料及使用量對3 種陰離子回收率的影響Fig. 4 Effect of the amount of purification materials on recoveries of three anions

2.3 方法學(xué)評價

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)

表2 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較Table 2 Comparison between matrix-matched calibration and solvent calibration

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中除目標(biāo)物以外的組分，對待測分析物測定值的影響，包括基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)和基質(zhì)減弱效應(yīng)。在UPLC-MS/MS分析中，需對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評價，并采取措施，保證結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。常見的降低基質(zhì)效應(yīng)的方法有基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液法、同位素內(nèi)標(biāo)法和減小進(jìn)樣量等[32]。本研究采用標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比較法[33]考察3 種陰離子在常見3 種蔬菜水果中的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表2。由表2可知，3 種離子都存在不同程度的基質(zhì)效應(yīng)，因此本研究采用配制基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)曲線降低基質(zhì)效應(yīng)。

2.3.2 線性范圍和檢出限

在優(yōu)化的分析條件下，配制3 種離子的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)UPLC-MS/MS測定后，以定量離子峰面積（y）為縱坐標(biāo)，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3 種離子在3 種基質(zhì)中的線性方程、線性相關(guān)系數(shù)、檢出限（RSN=3）和定量限（RSN=10）見表2。3 種離子在0.5～100 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，高氯酸鹽的檢出限為1.5 μg/kg，定量限為5.0 μg/kg；氯酸鹽的檢出限為1.0 μg/kg，定量限為3.0 μg/kg；溴酸鹽的檢出限為0.5 μg/kg，定量限為2.0 μg/kg。

2.3.3 回收率和精密度

稱取蘋果、梨和青菜3 種基質(zhì)空白樣品，添加5.0、20.0 μg/kg和50.0 μg/kg的混合離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，按優(yōu)化好的實驗方法進(jìn)行前處理，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明：3 種離子在3 種基質(zhì)中的平均回收率為80.3%～110.1%，RSD在2.1%～9.6%之間，滿足日常檢測需求。

表3 典型樣品中3 種離子的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of perchlorate, chlorate and bromate from spiked typical samples (n= 6)

2.3.4 實際樣品的檢測結(jié)果

采用本研究的方法對浙江杭州地區(qū)市場上抽檢的100 批次果蔬進(jìn)行測定。結(jié)果顯示：氯酸鹽檢出6 批次，主要包括生姜和青菜等，檢出范圍為15～75 μg/kg。高氯酸鹽檢出21 批次，主要包括韭菜、蘋果和橘子等，檢出范圍為30～800 μg/kg。實際樣品檢測表明，果蔬中有害陰離子污染發(fā)生率較高。陽性樣品提取離子色譜圖如圖5所示。

圖5 蔬菜樣品青菜（A）和生姜（B）提取離子色譜圖Fig. 5 Extracted ion chromatograms of two inorganic anions from actual positive vegetable samples

3 結(jié) 論

本研究建立了果蔬中高氯酸鹽、氯酸鹽和溴酸鹽的UPLC-MS/MS分析方法。通過優(yōu)化QuEChERS前處理方法，采用GCB和C18固相吸附劑凈化基質(zhì)，基質(zhì)匹配的標(biāo)樣進(jìn)行定量測定。同時應(yīng)用于實際樣品檢測。該方法快速便捷、靈敏可靠、回收率穩(wěn)定，適用于果蔬中高氯酸鹽、氯酸鹽和溴酸鹽的殘留分析。