譚 庶，楊金易，許吉華，沈玉棟，曾道平，蘇曉娜，鐘翠麗，許小炫，孫遠(yuǎn)明,

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642；2.吉安市公安局刑科所，江西 吉安 343000；3.溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，廣東 云浮 527499）

獸藥殘留是影響食品安全的一個(gè)重要因素，其中抗病毒藥物殘留問(wèn)題尤為突出[1]。金剛烷胺是常用于動(dòng)物治療的一種抗病毒藥物[2]，在動(dòng)物飼養(yǎng)過(guò)程中主要用于治療和預(yù)防禽流感和豬的傳染性胃腸炎。然而金剛烷類抗病毒藥物在動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中違禁使用的現(xiàn)象普遍發(fā)生，在生物機(jī)體內(nèi)以原藥形式蓄積的金剛烷胺可通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，產(chǎn)生神經(jīng)毒性等毒副作用[3-5]。其濫用還間接導(dǎo)致全世界范圍內(nèi)流感病毒的耐藥性日益嚴(yán)重[6-8]。2000—2012年間的流行病學(xué)調(diào)查表明，我國(guó)流感病毒對(duì)金剛烷胺的耐藥性由13.16%激增至80.00%，嚴(yán)重威脅人類健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展[9]。因此，2005年農(nóng)業(yè)部560號(hào)公告規(guī)定禁止將金剛烷胺類藥物應(yīng)用于動(dòng)物的病毒性疾病的防治以及相關(guān)的生產(chǎn)、銷售等。2006年美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局也禁止在家禽養(yǎng)殖中使用金剛烷胺和金剛乙胺等人類抗病毒藥物[10]。

雞肉是中國(guó)主要食用肉類之一，因其高蛋白、低脂肪和低膽固醇的特點(diǎn)而廣受歡迎。作為世界第三大雞肉生產(chǎn)國(guó)，2017年我國(guó)雞肉產(chǎn)量達(dá)1 160萬(wàn) t[11]。然而在肉雞飼養(yǎng)過(guò)程中，金剛烷胺的違規(guī)使用依然屢禁不止。2012年“速成雞”事件[12]再次讓金剛烷胺的濫用成為了民眾輿論的焦點(diǎn)。2013年日本厚生勞動(dòng)省醫(yī)藥食品局食品安全部發(fā)布通知，在進(jìn)口食品監(jiān)控計(jì)劃中加入對(duì)中國(guó)產(chǎn)雞肉中金剛烷胺的檢查[13]?，F(xiàn)階段，我國(guó)尚未建立有關(guān)食品中金剛烷胺檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，只有山東省和江蘇省分別建立了雞肉和雞肝中金剛烷胺殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法。隨著我國(guó)雞肉生產(chǎn)和消費(fèi)量增大，為保障消費(fèi)者健康安全和雞肉出口貿(mào)易的順利進(jìn)行，對(duì)雞肉及其相關(guān)產(chǎn)品中的金剛烷胺殘留量監(jiān)測(cè)十分必要。

目前已報(bào)道的檢測(cè)雞肉組織中金剛烷胺殘留的方法主要包括：高效液相色譜[14]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）[15-17]、親水相互作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[13]、生物識(shí)別材料親和檢測(cè)[18]等。雖然這些方法可靠且準(zhǔn)確，但通常采用復(fù)雜的樣品前處理和精密儀器并需要專業(yè)人員操作，檢測(cè)成本高，不適合大量樣品的快速檢測(cè)。近年來(lái)基于抗原-抗體特異性識(shí)別的基礎(chǔ)上發(fā)展的免疫檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附滴定[19-23]、免疫傳感器[24]、免疫層析試紙條[21-22]、免疫磁珠[25]、免疫比色分析[26-27]等。其中酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉且高檢測(cè)通量，是當(dāng)前快速檢測(cè)的主要方法。在構(gòu)建免疫檢測(cè)方法時(shí)，半抗原的設(shè)計(jì)與合成是關(guān)鍵步驟，直接決定了制備的抗體質(zhì)量的優(yōu)劣[28-30]。報(bào)道[20-21]顯示半抗原的復(fù)雜空間結(jié)構(gòu)和分子極性可能是產(chǎn)生高特異性抗體的關(guān)鍵，氨基的保留與否可能不影響抗體特異性，但大多數(shù)抗體表現(xiàn)出低親和力或?qū)€(gè)別藥物具有高選擇性。

本研究通過(guò)分析現(xiàn)有的金剛烷胺半抗原及其抗體，設(shè)計(jì)并制備一種針對(duì)金剛烷胺分子特點(diǎn)的新型半抗原，利用產(chǎn)生的金剛烷胺特異性單克隆抗體，擬建立一種與現(xiàn)有檢測(cè)方法相比更為靈敏、適用性強(qiáng)的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析（indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay，ic-ELISA）法，為進(jìn)一步研制雞肉中金剛烷胺殘留免疫檢測(cè)試劑盒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞肉樣品 市售；金剛烷胺、金剛乙胺、利巴韋林等標(biāo)準(zhǔn)品 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司上海分公司；N-(1-金剛烷基)肼甲酰胺（N-(1-adamantyl)hydrazine carboxamide)，ADHZ） 美國(guó)Matrix Scientific公司；乙醛酸（glyoxylic acid，GA） 上海麥克林生化科技有限公司；3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）由實(shí)驗(yàn)室制備并保存；N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxy succinimide，NHS）、碳化二亞胺鹽酸鹽（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide，EDC）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、鑰孔血藍(lán)蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）等生化試劑美國(guó)Sigma公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG（HRP-IgG） 碧云天生物技術(shù)研究所；96 孔微孔測(cè)定板 深圳金燦華實(shí)業(yè)有限公司；4 周齡SPF級(jí)Balb/c小鼠 廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞由廣東省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

包被液：碳酸鹽緩沖液；底物顯色液：TMB顯色液；洗液：Na2HPO4·12H2O 3.0 g、NaCl 8.5 g、吐溫-20 0.5 mL，用蒸餾水定容至1 L；磷酸緩沖液（phosphate buffer，PB）；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）；B液：Na2B4O7·10H2O 4.92 g、H3BO33.09 g、蔗糖100 g、魚明膠4 g、酪蛋白5 g，用蒸餾水定容至1 L；P液：Na2HPO4·12H2O 6.2 g、NaH2PO4·2H2O 0.8 g、蔗糖100 g、魚明膠4 g、酪蛋白5 g，用蒸餾水定容至1 L；T液：三羥甲基氨基甲烷14.6 g、濃鹽酸8.8 mL、蔗糖80 g、魚明膠4 g、酪蛋白5 g，用蒸餾水定容至1 L。

1.2 儀器與設(shè)備

JZ-II型均質(zhì)器 莆田市南榮貿(mào)易有限公司；超低溫高速離心機(jī) 美國(guó)Eppenndorf公司；Multiskan MK3酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司；氮吹儀 康寧科技有限公司；QP50質(zhì)譜儀 日本島津公司；1200系列液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；ZHJH-1122超凈工作臺(tái)上海新苗醫(yī)療器械公司。

1.3 方法

1.3.1 金剛烷胺半抗原的制備與鑒定

半抗原ADHZ-GA合成路線如圖1所示。稱取ADHZ 10.00 mg、GA 4.00 mg、甲醇250 μL放入圓底燒瓶中，滴加幾滴冰乙酸，再置于磁力攪拌器上，室溫?cái)嚢枰詰?yīng)48 h，會(huì)有沉淀析出。將以應(yīng)后的混合液在4 500 r/min離心15 min，棄去上清液，將沉淀于50 ℃真空干燥，最終得到白色固體粉末即為金剛烷胺半抗原，將半抗原溶解于合適有機(jī)溶劑，進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

圖1 金剛烷胺半抗原合成路線Fig. 1 Synthesis of hapten for amantadine detection

1.3.2 人工抗原的制備

參考史曉亞[31]的方法，采用活化酯法將金剛烷胺半抗原與BSA和KLH分別偶聯(lián)，作為包被原和免疫原。稱取ADHZ-GA 6.6 mg（25 μmol），EDC 4.8 mg（25 μmol），NHS 2.9 mg（20 μmol）溶到1 mL DMF中，室溫下避光以應(yīng)18 h，定為A液；稱量BSA 16.7 mg（0.25 μmol）或KLH 75.0 mg（0.025 μmol）溶于1 mL PBS，定為B液；把A液和B液混合，室溫?cái)嚢枰詰?yīng)3 h，再把此混合液倒入透析袋，并放入緩沖液中于4 ℃透析3 d，每隔8 h換1 次透析液，且透析液需提前置于4 ℃冰箱中。透析結(jié)束后移取透析袋中的上清液，并于4 ℃保存。

1.3.3 動(dòng)物免疫與特異性單克隆抗體的制備

參考Peng Dapeng等[19]的方法，選取6～8 周齡的雌性Balb/c小鼠，將上述免疫原免疫3 只小鼠。先將KLH-抗原肽偶聯(lián)物免疫原時(shí)用生理鹽水稀釋成1 mg/mL，按每只小鼠注射100 mL的劑量，共免疫4 次。首次免疫加完全弗氏佐劑，皮下多點(diǎn)注射；2 周后免疫原加不完全弗氏佐劑，同樣皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫。此后每2 周加強(qiáng)免疫1 次，在第4次免疫后1 周對(duì)小鼠進(jìn)行剪尾收集血清，并使用ic-ELISA測(cè)定抗血清滴度。在細(xì)胞融合前3 d對(duì)產(chǎn)生最高滴度抗血清的小鼠加強(qiáng)免疫，直接腹腔注射0.5 mL相應(yīng)抗原（不加佐劑）。以10∶1的比例將免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，并在37 ℃、5% CO2條件下的HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在融合約7 d后，用ic-ELISA選擇和標(biāo)記效價(jià)高、抑制率高的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞經(jīng)有限稀釋法亞克隆3 次均為100%的陽(yáng)性后，建立細(xì)胞株并凍存。并將雜交瘤細(xì)胞接種于小鼠腹腔，制備腹水，使用Protein G親和層析法純化單抗備用。

1.3.4 特異性單克隆抗體免疫學(xué)特性的鑒定

1.3.4.1 抗體腹水效價(jià)及親和力鑒定

用紫外分光光度法測(cè)定純化后的單克隆抗體蛋白濃度，采用ic-ELISA法測(cè)定抗體腹水的效價(jià)及抗體親和力，用親和常數(shù)Ka表示親和力的大小。

1.3.4.2 特異性測(cè)定

選擇與金剛烷胺具有類似結(jié)構(gòu)或功能的8 種藥物金剛乙胺、利巴韋林、嗎啡胍、諾氟沙星、氟苯尼考、喹乙醇代謝物、氯霉素進(jìn)行ic-ELISA測(cè)定，通過(guò)各種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別得到其IC50，交叉以應(yīng)率計(jì)算公式如下：

1.3.5 ic-ELISA基本步驟

包被：用包被液將包被抗原稀釋至相應(yīng)的最適濃度，包被96 孔酶標(biāo)板，每孔100 μL，4 ℃過(guò)夜孵育；封閉：經(jīng)每孔300 μL洗液洗滌2 次后，每孔加入120 μL封閉液，37 ℃孵育3 h，甩干孔中的液體，置于37 ℃烘箱中2 h備用；競(jìng)爭(zhēng)以應(yīng)：加入金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液（50 μL/孔），再加入50 μL稀釋好的抗體工作液，25 ℃以應(yīng)一定時(shí)間；加酶標(biāo)二抗：洗滌5 次，每孔加入100 μL用P液稀釋好的酶標(biāo)二抗25 ℃以應(yīng)20 min；顯色：洗滌5 次，每孔加入顯色液100 μL，25 ℃顯色10 min。

終止以應(yīng)：每孔加入50 μL終止液（10% H2SO4），酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。以金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)（X），以抑制率為縱坐標(biāo)（Y），應(yīng)用Origin 8.5軟件中的四參數(shù)擬合競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 ic-ELISA法優(yōu)化

1.3.6.1 包被原及單克隆抗體的稀釋倍數(shù)組合

利用方陣滴定對(duì)包被抗原、抗體的最適工作濃度進(jìn)行優(yōu)化，將包被用偶聯(lián)抗原用包被緩沖液分別按1∶2 500、1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000、1∶40 000、1∶80 000稀釋，抗體分別按1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000 和1∶40 000稀釋，按照1.3.5節(jié)的步驟操作，測(cè)定0 μg/L和48.6 μg/L的金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.3.6.2 優(yōu)化藥物稀釋液、抗體稀釋液、二抗稀釋倍數(shù)、競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間

選擇去離子水、PBST、PBS和PB作藥物稀釋液配制標(biāo)準(zhǔn)品，選擇T液、P液和B液作抗體稀釋液配制抗體溶液，分別用P液稀釋酶標(biāo)二抗不同倍數(shù)，選擇競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間為20、25、30 min和40 min，按照1.3.5節(jié)步驟操作，以Amax、IC50及Amax/IC50作為評(píng)價(jià)各影響因素的標(biāo)準(zhǔn)。選擇Amax在1.5～2.0之間，Amax/IC50最高，IC50最低時(shí)的條件為ic-ELISA的最佳以應(yīng)條件。

1.3.7 樣品前處理

將雞胸肉去除脂肪并勻漿化，準(zhǔn)確稱取2.00 g樣品于50 mL離心管中，加入6 mL乙腈，100 μL 0.1 mol/L鹽酸，劇烈振蕩2 min，室溫4 000 r/min離心5 min；取4 mL上清液于離心管中，于60 ℃氮?dú)饣蚩諝獯蹈?；加?.5 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液，充分渦動(dòng)30 s；取50 μL進(jìn)行ic-ELISA分析。

向空白雞肉樣品中分別添加高、中、低3 個(gè)質(zhì)量濃度的金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)前處理后用同一批次包被酶標(biāo)板對(duì)同批樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品設(shè)4 個(gè)重復(fù)，計(jì)算批內(nèi)變異；用不同批次包被酶標(biāo)板對(duì)同批樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品設(shè)4 個(gè)重復(fù)，計(jì)算批間變異。

1.3.8 儀器方法確證

雞肉中金剛烷胺含量的儀器方法測(cè)定參照DB 21/2394—2014《雞肝和雞肉中金剛烷胺、金剛乙胺的檢測(cè) 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表分析

根據(jù)樣品A450nm值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的質(zhì)量濃度，乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際質(zhì)量濃度，使用Origin 8.5軟件繪制相關(guān)ic-ELISA圖表。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用SAS 6.12軟件計(jì)算完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 半抗原合成的鑒定

比較其他文獻(xiàn)中的金剛烷胺半抗原（表1）可知，這些半抗原的共同結(jié)構(gòu)由金剛烷組成，表明金剛烷在動(dòng)物免疫系統(tǒng)以應(yīng)中可能比氨基更重要。Wu Songsong等[22]直接采用戊二醛的醛基與金剛烷胺和載體蛋白氨基縮合成Schiff堿而進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)合成金剛烷胺全抗原，其抗體靈敏度較低，IC50為11.93 μg/L；Peng Dapeng等[19]研究表明加入丁二酸酐與金剛烷胺氨基結(jié)合生成酰胺作為金剛烷胺半抗原，IC50為15.8 μg/L，這可能因?yàn)橛脕?lái)產(chǎn)生抗體的半抗原具有相對(duì)低的分子極性，這對(duì)產(chǎn)生高親和力的抗體無(wú)益。Wang Zhaopeng等[20]將4-(氯磺酰基)苯甲酸與金剛烷胺在4-二甲氨基吡啶催化下磺?；铣山饎偼榘钒肟乖?，其IC50為0.84 μg/L；Xu Liguang等[21]研究表明加入二碳酸二叔丁酯保護(hù)氨基，然后加入6-溴己酸乙酯偶聯(lián)，水解酯鍵得到金剛烷胺半抗原，其IC50為1.92 μg/L；但是這兩者半抗原合成路線復(fù)雜且與金剛乙胺交叉較大，不利于實(shí)際檢測(cè)。說(shuō)明半抗原連接臂的結(jié)構(gòu)選擇和長(zhǎng)度與抗體特異性有關(guān)。

基于金剛烷是抗原決定簇的假設(shè)，而且ADHZ與金剛烷胺結(jié)構(gòu)類似，直接設(shè)計(jì)了半抗原ADHZ-GA（圖1），為了在人工抗原表面突顯出半抗原的特征結(jié)構(gòu)，以利于產(chǎn)生具有高特異性的抗體[31]，半抗原引入席夫堿結(jié)構(gòu)、羧基暴露分子結(jié)構(gòu)，增加了特異性抗體產(chǎn)生的免疫原性。本研究所制備半抗原經(jīng)層析初步鑒定純度后，再經(jīng)質(zhì)譜手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)的鑒定。結(jié)果顯示成功制得目標(biāo)半抗原。

表1 金剛烷胺半抗原對(duì)比Table 1 Comparison of haptens used for determination of AMA

2.2 雜交瘤細(xì)胞株的建立

研究結(jié)果表明，融合細(xì)胞經(jīng)3 次克隆后陽(yáng)性率達(dá)100%，分離得到穩(wěn)定分泌抗金剛烷胺抗體的雜交瘤細(xì)胞，命名為3E7。

2.3 抗金剛烷胺抗體的鑒定

2.3.1 腹水效價(jià)及單抗質(zhì)量濃度

采用間接ELISA法檢測(cè)純化后抗體腹水效價(jià)，結(jié)果表明，效價(jià)在1.60×106以上。用紫外分光光度法測(cè)定純化后單抗蛋白質(zhì)量濃度為4.9 mg/mL。

2.3.2 親和力鑒定

本研究利用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA測(cè)定單克隆抗體親和力，根據(jù)公式計(jì)算單克隆抗體3E7的親和常數(shù)為4.92×107L/mol，一般認(rèn)為親和力高的抗體親和常數(shù)在107～1012L/mol之間，親和力較好。

2.3.3 特異性鑒定

表2 金剛烷胺單克隆抗體ic-ELISA交叉反應(yīng)率Table 2 Cross-reactivity of monoclonal antibody determined by ic-ELISA

由表2可知，制備的金剛烷胺抗體特異性好，但是金剛烷胺與金剛乙胺其交叉以應(yīng)率為29.89%，這是因?yàn)樵撐镔|(zhì)為金剛烷胺一結(jié)構(gòu)類似物，其結(jié)構(gòu)極其類似，僅比金剛烷胺多出一個(gè)亞甲基，所以存在少量交叉，但在實(shí)際檢測(cè)中，金剛乙胺較少使用在禽病的預(yù)防與治療。除金剛乙胺以外，與結(jié)構(gòu)類似物和功能類似物的交叉以應(yīng)率均小于0.01%，受其他化合物的影響小，不易出現(xiàn)假陽(yáng)性、錯(cuò)檢等現(xiàn)象。

2.4 抗體、抗原最適工作質(zhì)量濃度的確定

依據(jù)實(shí)際ic-ELISA檢測(cè)的經(jīng)驗(yàn)，為后續(xù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，當(dāng)0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)液A450nm值為1.6～2.2，最高質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液（48.6 μg/L）的A450nm值在0.1～0.3之間時(shí)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的梯度和線性關(guān)系較好。

表3 包被抗原稀釋倍數(shù)及抗體稀釋倍數(shù)的確定（n=2）Table 3 Determination of optimal dilution of coating antigen and monoclonal antibody (n= 2)

由表3可以看出，當(dāng)包被抗原稀釋80 000 倍，單抗稀釋20 000 倍時(shí)陰性標(biāo)準(zhǔn)液和質(zhì)量濃度為48.6 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)液的A450nm值分別為1.846和0.248，陰陽(yáng)對(duì)照品的A450nm值之比最大。因此最佳包被原稀釋倍數(shù)為80 000，抗體工作質(zhì)量濃度為122.5 μg/L。

2.5 優(yōu)化藥物稀釋液、抗體稀釋液、二抗稀釋倍數(shù)、競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間

抗體和藥物在不同緩沖體系里分散能力不同，所以需要選擇抗體和藥物最適合的溶劑；以應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)短決定抗原抗體是否充分結(jié)合，所以要優(yōu)化競(jìng)爭(zhēng)以應(yīng)時(shí)間達(dá)到最佳以應(yīng)程度。蛋白質(zhì)性質(zhì)不同，抗原抗體以應(yīng)所需最佳質(zhì)量濃度、緩沖體系、離子濃度、以應(yīng)時(shí)間等參數(shù)也有所差異。不同藥物稀釋液條件下Amax、IC50和Amax/IC50的比較如圖2所示，選擇PB作為藥物稀釋液時(shí)，其IC50較低，同時(shí)Amax/IC50最高，故選擇PB作為藥物稀釋液；不同抗體稀釋液、二抗稀釋倍數(shù)和競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間條件下Amax、IC50和Amax/IC50的比較如圖3～5所示，同理可得出抗體稀釋液為P液，酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)為8 000，競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間30 min為最佳以應(yīng)條件。

圖2 金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的優(yōu)化Fig. 2 Optimization of dilution of amantadine standard

圖3 抗體稀釋液的優(yōu)化Fig. 3 Optimization of dilution solution for monoclonal antibody

圖4 酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)的優(yōu)化Fig. 4 Optimization of dilution degree of enzyme-labelled antibody

圖5 競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間的優(yōu)化Fig. 5 Optimization of competition time

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按照上述ELISA條件優(yōu)化結(jié)果，得到金剛烷胺間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的最佳以應(yīng)條件，即包被抗原與單抗最佳工作質(zhì)量濃度分別為12.5 μg/L和122.5 μg/L，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為PB緩沖液，抗體稀釋液為P液，酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)為8 000，最佳競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間為30 min。在此最佳以應(yīng)條件下繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其曲線的回歸方程為：Y=-28.914X+42.313，相關(guān)系數(shù)R2為0.994 6，IC50為0.69 μg/L，線性檢測(cè)范圍（IC20～I(xiàn)C80）為0.07～6.15 μg/L。

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

ic-ELISA法準(zhǔn)確度以回收率表示，選擇高、中、低3 個(gè)添加水平進(jìn)行金剛烷胺添加回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。其中所測(cè)樣品中金剛烷胺平均回收率在101.69%～108.71%之間，且批間和批內(nèi)變異系數(shù)低于15%。方法準(zhǔn)確度能達(dá)到檢測(cè)要求，適用于實(shí)際樣品中金剛烷胺的檢測(cè)。

表4 金剛烷胺的實(shí)際雞肉樣品回收率和變異系數(shù)（n=4）Table 4 Recoveries and coefficients of variation for AMA in chicken samples (n= 4)

2.8 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

批內(nèi)變異測(cè)定：每一標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度作6 次重復(fù)，以其批內(nèi)變異系數(shù)表示批內(nèi)誤差；批間變異測(cè)定：按照上述優(yōu)化條件分別作標(biāo)準(zhǔn)曲線，取不同批次包被的酶標(biāo)板，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度每天作一次分析，連續(xù)進(jìn)行6 d測(cè)定，綜合6 d測(cè)得質(zhì)量濃度進(jìn)行分析，以其批間變異系數(shù)表示批間誤差。如表5所示，當(dāng)金剛烷胺質(zhì)量濃度為0.2、0.6 μg/L時(shí)，變異較大，當(dāng)質(zhì)量濃度在1.8～16.2 μg/L范圍內(nèi)，變異系數(shù)均小于10%，表明該方法重復(fù)性較好。通過(guò)在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，在適當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間間隔內(nèi)（每天）和實(shí)驗(yàn)所確立的條件下，不同時(shí)間內(nèi)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如表6所示，IC50、Amax的變異系數(shù)均小于15%，表明在不同時(shí)間內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒的性能（IC50、Amax）比較穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重復(fù)性較好。

表5 樣品測(cè)定批內(nèi)變異（n=6）Table 5 Intra-assay coef fi cients of variation of the standard curve (n= 6)

表6 樣品測(cè)定批間變異（n=6）Table 6 Inter-assay coef fi cients of variation of the standard curve (n= 6)

2.9 儀器方法對(duì)比

從市場(chǎng)購(gòu)得的100 只肉雞，收集雞胸肉并均質(zhì)化，-20 ℃保存。按照實(shí)驗(yàn)建立的ic-ELISA法檢測(cè)所有雞肉樣品中金剛烷胺，以DB 21/2394—2014的檢出限（0.5 μg/kg）作為陰陽(yáng)性判定值，其中檢出9 份樣品為陽(yáng)性，91 份樣品為陰性，將可疑樣品和9 份陰性樣品分別再用ic-ELISA法和HPLC-MS法檢測(cè)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較測(cè)定結(jié)果。以HPLC-MS所測(cè)得的金剛烷胺含量為Y軸，以ic-ELISA測(cè)得的金剛烷胺含量為X軸，繪制散點(diǎn)圖。對(duì)2 種方法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析，如圖6所示?；貧w方程為：Y=0.81X-0.03，R2=0.970 2，說(shuō)明建立的ic-ELISA法的測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

圖6 ic-ELISA與HPLC-MS方法對(duì)比Fig. 6 Comparison between ic-ELISA and HPLC-MS

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)設(shè)計(jì)并合成一種新型的金剛烷胺半抗原，制備特異性的金剛烷胺特異性單克隆抗體，通過(guò)優(yōu)化ic-ELISA以應(yīng)條件，建立檢測(cè)雞肉中金剛烷胺殘留的ic-ELISA法。該方法的IC50為0.69 μg/L，線性檢測(cè)范圍為0.07～6.15 μg/L，檢出限為0.21 μg/L；除金剛乙胺外，與其余結(jié)構(gòu)及功能類似物均無(wú)交叉以應(yīng)，方法特異性好；雞肉中金剛烷胺的添加回收率為101.69%～108.71%，批間和批內(nèi)變異系數(shù)均小于15%；實(shí)際樣品檢測(cè)中，ic-ELISA與HPLC-MS方法檢測(cè)結(jié)果符合，整個(gè)檢測(cè)以應(yīng)時(shí)間需60 min左右。這些數(shù)據(jù)表明本實(shí)驗(yàn)建立金剛烷胺殘留檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度、精密度、靈敏度較高，可用于雞肉中金剛烷胺殘留的快速定量檢測(cè)。