牛瑜琦，馬曉斐，李 揮，張敬軒,，高文惠,

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北冠卓檢測(cè)科技股份有限公司，河北 石家莊 051130；3.河北省醫(yī)療器械與藥品包裝材料檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050061）

辣椒紅色素是一類存在于成熟的紅辣椒的果皮中的天然植物提取物著色劑，屬于類胡蘿卜素，具有著色力強(qiáng)、色澤鮮艷、保色效果好、無毒無害等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于食品、藥品、飲料、化妝品、農(nóng)副加工產(chǎn)品等，使用范圍和市場(chǎng)需求日益增長(zhǎng)，其質(zhì)量安全備受關(guān)注。然而由于環(huán)境污染，工業(yè)染料存在于土壤、空氣等環(huán)境中，在紅辣椒的生長(zhǎng)過程中可能會(huì)帶入一些非食用色素物質(zhì)，或者在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過程中污染植物；在辣椒紅色素的制備過程中，伴隨著提取、精制等加工過程而濃縮富集，同時(shí)非食用色素在提取過程中不易揮發(fā)、降解，從而導(dǎo)致在辣椒紅色素中含有一定量這類有害物質(zhì)，并最終轉(zhuǎn)移至食品中，導(dǎo)致食品安全問題[1-5]。辣椒紅色素基質(zhì)復(fù)雜，檢測(cè)干擾大，從環(huán)境可能帶入的非食用色素種類多，含量低。因此，亟待需要高靈敏度、高特異性的檢測(cè)技術(shù)。

目前，對(duì)于非食用色素的檢測(cè)方法主要有免疫法[6-7]、電化學(xué)分析法[8-9]、薄層色譜法[10-11]、液相色譜法[12-14]、高效液相色譜-質(zhì)譜法[15-17]等。免疫法不滿足多殘留藥物同時(shí)檢測(cè)，易出現(xiàn)假陰性或假陽性以應(yīng)。電化學(xué)分析法和薄層色譜法特異性差、靈敏度低、選擇性不高、定性能力較差。液相色譜法靈敏度較低、選擇性差。高效液相色譜-質(zhì)譜法因具有高的靈敏度、特異性和抗干擾能力，已成為痕量藥物分析的首選方法。陳林等[18]采用改良QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged and safe）技術(shù)作為前處理方法，建立了辣椒制品中14 種非法添加工業(yè)染料的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用快速檢測(cè)方法；路楊等[19]采用凝膠滲透色譜儀作為前處理設(shè)備，采用超高效液相色譜儀作為檢測(cè)設(shè)備，建立辣椒油和火鍋底料中的10 種工業(yè)染料的檢測(cè)方法。同時(shí)，針對(duì)當(dāng)前天然植物提取物中非食用色素檢測(cè)技術(shù)缺失，缺乏相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，建立高通量超痕量的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室內(nèi)、間的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，考察方法學(xué)指標(biāo)，為食品安全監(jiān)管和溯源提供技術(shù)依據(jù)。因此，對(duì)植物提取物中非食用色素的檢測(cè)方法技術(shù)進(jìn)行研究非常必要。另外，傳統(tǒng)的前處理方法比較耗時(shí)費(fèi)力，而QuEChERS法萃取具有“快速、簡(jiǎn)易、廉價(jià)、有效、穩(wěn)定、安全”的特點(diǎn)[20-26]，該方法是Anastassiades等[27]于2002年首先在歐洲農(nóng)藥殘留研討會(huì)提出，并于2003年正式發(fā)表了一種用于水果、蔬菜、谷物等低脂產(chǎn)品中多農(nóng)藥殘留分析的前處理方法。QuEChERS方法具有技術(shù)要求低、操作簡(jiǎn)單、無需使用大量有機(jī)溶劑、分析過程快速等優(yōu)點(diǎn)。

本研究以辣椒紅色素為研究對(duì)象，選用QuEChERS前處理法，分別對(duì)提取溶劑、脫水劑、吸附劑進(jìn)行優(yōu)化，建立QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，并對(duì)前處理基質(zhì)效應(yīng)和建立的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)和驗(yàn)證。為辣椒制品的食品添加劑中非法添加工業(yè)染料的檢測(cè)提供一種更加快速、簡(jiǎn)便的技術(shù)支持，解決高濃縮提取物基質(zhì)干擾嚴(yán)重的難題，為食品中非食用物質(zhì)溯源技術(shù)提供參考，為食品安全監(jiān)管提供有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣椒紅色素樣品 晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司；乙腈、甲醇、乙酸（均為色譜純） 德國(guó)默克公司；乙酸乙酯、正己烷、乙醚（均為分析純） 賽默飛世爾科技有限公司；氯化鈉為分析純；實(shí)驗(yàn)所用水均為超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm）；蘇丹紅I（100 μg/mL）、蘇丹紅II（100 μg/mL）、蘇丹紅III（100 μg/mL）、蘇丹紅IV（100 μg/mL）、羅丹明B（95.52%）、堿性橙II（99.6%）、堿性橙21（98%）、堿性橙22（99.9%）、堿性嫩黃（79.5%）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；C18、N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）吸附劑 中國(guó)Agela Technologies公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LCQ超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源及Xcalibur1.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國(guó)Finnigan公司；HP 1100高效液相色譜系統(tǒng)（配有可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器和Rev.A.06.03色譜工作站） 美國(guó)惠普公司；CT18RT型高速臺(tái)式離心機(jī) 上海天美公司；渦旋混合器 大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；KQ-500E型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取10 mg羅丹明B、堿性橙II、堿性橙21、堿性橙22、堿性嫩黃標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈定容配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液，將蘇丹紅I、蘇丹紅II、蘇丹紅III、蘇丹紅IV貯存在棕色儲(chǔ)存瓶中，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r(shí)，取各單標(biāo)儲(chǔ)備液適量，用初始比例流動(dòng)相（0.1%甲酸溶液-乙腈（95∶5，V/V）配制成不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 樣品的前處理

稱取辣椒紅色素樣品2.0 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入10 mL 50%的乙腈溶液渦旋混勻，加入3 g氯化鈉進(jìn)行鹽析，加入300 mg C18吸附劑凈化后，渦旋混合2 min，超聲提取10 min，以5 000 r/min離心5 min，取上清液。再加入10 mL 50%的乙腈溶液重復(fù)提取一次，合并2 次上清液用50%的乙腈溶液定容至20 mL。取1 mL經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣測(cè)定。

1.3.3 色譜條件

Waters XBridge BEH C18（100 mm×2.1 mm，2.5 μm）分析柱；流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈。梯度洗脫程序：0.1～1 min，5% B；1～3.5 min，5%～98% B；3.5～10.0 min，98% B；10.0～10.5 min，98%～5% B。流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量2 μL。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；正離子掃描；多以應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）；離子源溫度500 ℃；離子源電壓5 000 V；霧化氣、氣簾氣、輔助氣和碰撞氣均為高純氮?dú)狻RM檢測(cè)離子對(duì)、去簇電壓及碰撞電壓見表1。

表1 9 種非食用色素的質(zhì)譜優(yōu)化條件Table 1 Optimized mass spectrometric parameters for 9 inedible pigments

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和處理采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的Xcalibur1.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，圖表繪制采用Microsoft Office Excel 2007版。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的優(yōu)化

考察常用的提取溶劑乙腈、甲醇、乙酸乙酯、正己烷、乙醚作為提取劑時(shí)其提取效果的對(duì)比實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)以樣品中目標(biāo)物的回收率作為提取效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)。辣椒紅色素能很好溶于乙腈和甲醇中，但結(jié)果表明乙腈提取效果比甲醇好；而正己烷、乙醚和乙酸乙酯作為提取溶劑時(shí)，不僅提取液中雜質(zhì)較多，且提取效果欠佳。所以采用乙腈作為提取溶劑。

圖1 乙腈溶液體積分?jǐn)?shù)對(duì)目標(biāo)物回收率的影響Fig. 1 Effect of ratio between acetonitrile and water on recoveries of target compounds

由于辣椒紅色素基質(zhì)復(fù)雜，在乙腈中加入適量的水有利于對(duì)辣椒紅色素樣品中雜質(zhì)的去除，實(shí)驗(yàn)選取體積分?jǐn)?shù)10%、20%、50%、80%、100%的乙腈溶液作為提取溶劑，結(jié)果如圖1所示。50%乙腈溶液提取時(shí)具有較好峰形，且9 種非食用色素的回收率均較高，提取效果最好。故選擇50%乙腈溶液作為提取溶劑。

2.2 凈化條件的優(yōu)化

圖2 吸附劑對(duì)目標(biāo)物回收率的影響Fig. 2 Effect of sorbents on recoveries of target compounds

常用的吸附劑有PSA、球形ODS C18填料、NH2氨基填料等[20-28]。辣椒紅色素中富含色素、油脂等成分，根據(jù)辣椒紅色素的基質(zhì)特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)選取了PSA、C18以及PSA與C18兩種吸附劑組合作為考察對(duì)象用于前處理，如圖2所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PSA對(duì)非食用色素會(huì)有一定量的吸附作用，C18對(duì)辣椒紅色素中油脂等雜質(zhì)有較好的吸附效果，基質(zhì)干擾小，且目標(biāo)化合物的回收率更高。實(shí)驗(yàn)還對(duì)C18吸附劑的用量進(jìn)行優(yōu)化，如圖3所示。結(jié)果表明，吸附劑的用量越多吸附效果越好，但過多的吸附劑可以吸附目標(biāo)化合物使回收率降低，當(dāng)吸附劑的用量在300 mg時(shí)具有較好的吸附效果。

圖3 C18用量對(duì)目標(biāo)物回收率的影響Fig. 3 Effect of C18 dosage on recoveries of target compounds

2.3 超高效液相色譜條件的優(yōu)化

圖4 9 種非食用色素的MRM色譜圖Fig. 4 MRM chromatograms of 9 inedible pigments

9 種非食用色素中的4 種蘇丹紅具有相似的基團(tuán)和結(jié)構(gòu)，為了準(zhǔn)確定量，需色譜峰間有一定分離度。實(shí)驗(yàn)考察甲醇、乙腈、5 mmol/L乙酸銨溶液、0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相，采用梯度洗脫技術(shù)，在C18色譜柱上進(jìn)行色譜分離，結(jié)果表明，甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，9 種非食用色素分離度低，峰形較差，質(zhì)譜響應(yīng)較低；當(dāng)以乙腈-乙酸銨和乙腈-0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)物峰形較好，但乙腈-0.1%甲酸溶液體系靈敏度更高，分離效果更好，如圖4所示。因此，選擇0.1%甲酸溶液-乙腈作為流動(dòng)相，采用1.3.3節(jié)的梯度洗脫程序。

2.4 質(zhì)譜條件的確立

非食用色素在質(zhì)譜的行為較為復(fù)雜，將質(zhì)量濃度為100 ng/mL的蘇丹紅I、蘇丹紅II、蘇丹紅III、蘇丹紅IV、羅丹明B、堿性橙II、堿性橙21、堿性橙22、堿性嫩黃9 種標(biāo)準(zhǔn)溶液，針泵進(jìn)樣進(jìn)入質(zhì)譜系統(tǒng)，采用Q1全掃描和碎片離子掃描確定其母離子和子離子，在針泵進(jìn)樣過程中優(yōu)化碎裂電壓、碰撞電壓等儀器參數(shù)。每種分析物要選擇最強(qiáng)且穩(wěn)定的離子作為定量離子，另一個(gè)則為定性離子。9 種非食用色素的質(zhì)譜條件經(jīng)優(yōu)化后結(jié)果見表1。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 特異性

采用多以應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，提取偏差在±0.005‰范圍內(nèi)的精確m/z的色譜圖進(jìn)行定量，加之色譜保留時(shí)間，方法的特異性高，沒有發(fā)現(xiàn)有干擾成分影響9 種目標(biāo)物的測(cè)定。在空白樣品和空白樣品添加的色譜質(zhì)譜圖中未發(fā)現(xiàn)干擾峰，說明方法具有較好的選擇性。

2.5.2 基質(zhì)效應(yīng)、線性關(guān)系、檢出限和定量限

1.3.2 節(jié)前處理凈化方法的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，其結(jié)果見表2，其中堿性橙II的基質(zhì)效應(yīng)最強(qiáng)，為0.07，其余均在-0.17～0.06之間。雖然9 種非食用色素均有一定的基質(zhì)效應(yīng)影響，但并不影響測(cè)定的準(zhǔn)確性。有文獻(xiàn)研究基質(zhì)效應(yīng)在-0.20～0.20之間可以不考慮基質(zhì)效應(yīng)的影響[29-31]。

用空白樣品處理液按照1.3.1節(jié)配成系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用分析物峰面積對(duì)被測(cè)組分的質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表2可知，堿性橙II、堿性橙21、堿性橙22、堿性嫩黃在0.2～8 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，蘇丹紅I、蘇丹紅II、蘇丹紅III、蘇丹紅IV、羅丹明B在2～40 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其線性相關(guān)系數(shù)R2高于0.995 0。

以3 倍和10 倍信噪比分別確定了方法的檢出限和定量限，結(jié)果見表2。9 種分析物的定量限在0.6～5.0 ng/g之間。

表2 方法的線性、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限和定量限Table 2 Linearity, matrix effect, LODs and LOQs of the method

2.5.3 準(zhǔn)確度和精密度

在3 個(gè)水平下做樣品加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，考察方法的準(zhǔn)確度和精密度（表3），平均回收率結(jié)果在69.6%～92.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在2.8%～8.5%之間。說明方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

表3 方法的回收率和精密度（n= 5）Table 3 Recoveries and precision of the method (n= 5)

2.6 辣椒紅色素樣品的測(cè)定結(jié)果

圖5 含有非食用色素的辣椒紅色素樣品Fig. 5 Detection of inedible pigments present in real sample

用實(shí)驗(yàn)建立的方法檢測(cè)20 種辣椒紅色素樣品，在其中1 個(gè)樣品中含有微量的蘇丹紅染料（圖5），但含量低于我國(guó)規(guī)定的最大殘留量1.0 μg/kg。

3 結(jié) 論

通過優(yōu)化和對(duì)比實(shí)驗(yàn)，探討QuEChERS提取及凈化等前處理?xiàng)l件，考察辣椒紅色素樣品的基質(zhì)效應(yīng)，優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件，研究方法的回收率、檢出限和定量限等技術(shù)指標(biāo)，實(shí)現(xiàn)了辣椒紅色素樣品中9 種非食用色素的同時(shí)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，方法的基質(zhì)效應(yīng)在-0.17～0.07之間，檢出限在0.2～1.5 ng/g之間，定量限在0.6～5.0 ng/g之間，堿性橙II、堿性橙21、堿性橙22、堿性嫩黃在0.2～8 ng/mL范圍內(nèi)呈線性，蘇丹紅I、蘇丹紅II、蘇丹紅III、蘇丹紅IV、羅丹明B在2～40 ng/mL范圍內(nèi)呈線性，目標(biāo)物線性相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.995 0，3 個(gè)樣品加標(biāo)水平的平均回收率在69.6%～92.5%之間，RSD在2.8%～8.5%之間（n=5）。該方法簡(jiǎn)單快捷、準(zhǔn)確可靠，適合于市售辣椒紅色素中非食用色素的快速檢測(cè)。