吳進(jìn)菊，曾瑞萍，張俊毅，張一舟，余海忠，于 博

（湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院·化學(xué)工程學(xué)院，湖北 襄陽 441053）

傳統(tǒng)發(fā)酵食品制作和食用歷史悠久，發(fā)酵系統(tǒng)開放，其中蘊(yùn)藏了豐富的微生物資源[1]。近年來隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，高通量測序技術(shù)廣泛地用于發(fā)酵食品微生物多樣性的研究，如酸魚[2]、意大利香腸[3]、食醋[4-5]、甜面醬[6]、發(fā)酵酒[7-10]、發(fā)酵蔬菜[11-14]、發(fā)酵豆制品[15-19]、發(fā)酵乳[20-22]等。

湖北襄陽大頭菜是我國四大名腌菜之一，是襄陽市地理標(biāo)志產(chǎn)品，具有2 000多年種植史，相傳是三國時(shí)期被諸葛亮發(fā)現(xiàn)并引入軍中廣泛食用，故又名諸葛菜。襄陽大頭菜需經(jīng)歷長達(dá)數(shù)月的發(fā)酵過程才能成熟。襄陽大頭菜的制作采用“三腌、五鹵、六曬”的傳統(tǒng)工藝，在發(fā)酵過程中逐步加入食鹽，大頭菜成熟時(shí)發(fā)酵液中的食鹽含量幾乎達(dá)到飽和狀態(tài)。目前，對傳統(tǒng)發(fā)酵大頭菜中微生物群落結(jié)構(gòu)、種群多樣性的研究相對較少，早期的研究基本是建立在傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)方法上[23-25]，近年來有研究人員采用聚合酶鏈?zhǔn)揭詰?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）-變性梯度凝膠電泳技術(shù)和高通量測序技術(shù)對襄陽大頭菜腌制液膜醭進(jìn)行了多樣性分析[26-28]，主要針對襄陽大頭菜正常發(fā)酵腌制液和長膜腌制液中細(xì)菌和真菌多樣性進(jìn)行比較研究，找出引起發(fā)酵液長膜的主要微生物，為后續(xù)控制大頭菜的品質(zhì)提供一定的幫助。

本實(shí)驗(yàn)采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對不同發(fā)酵時(shí)期傳統(tǒng)發(fā)酵大頭菜的真菌多樣性和菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，從基因水平全面揭示傳統(tǒng)發(fā)酵大頭菜發(fā)酵過程中真菌的多樣性和群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化，以期為今后傳統(tǒng)發(fā)酵大頭菜的工業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大頭菜發(fā)酵液樣本 湖北孔明菜食品有限公司；FastPfu polymerase 北京全式金生物技術(shù)有限公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司；QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng) Promega公司；DL2000 DNA Marker 寶生物工程（大連）有限公司；土壤基因組提取試劑盒 美國MP Biomedicals公司。

1.2 儀器與設(shè)備

9700型PCR儀 美國ABI公司；MiSeq高通量測序平臺 美國Illumina公司；臺式冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；NanoDrop 2000紫外-可見分光光度計(jì)賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

大頭菜發(fā)酵液樣本由湖北孔明菜食品有限公司提供，采用“三腌、五鹵、六曬”的傳統(tǒng)工藝進(jìn)行加工，按照加工工序的特點(diǎn)，在每一道腌制和鹵制工序完成后采集樣本，分別編號為1_1～1_8，每個(gè)發(fā)酵時(shí)期平行取3 個(gè)樣本，分別編號為a、b和c。樣本采集后低溫運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣本總DNA的提取和PCR

將大頭菜發(fā)酵液樣本送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，采用土壤基因組提取試劑盒提取總DNA。以樣本中微生物總DNA為模板，以ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和ITS2R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）為上下游引物擴(kuò)增真菌的ITS基因序列[29]。PCR采用20 μL（下同）以應(yīng)體系：總DNA 10 ng，5×FastPfu buffer 4 μL，dNTP mixture（各2.5 mmol/L）2 μL，上下游引物（各5 μmol/L）0.8 μL，F(xiàn)astPfu polymerase 0.4 μL，牛血清白蛋白0.2 μL，添加雙蒸水補(bǔ)充至20 μL。PCR條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.3.3 Illumina MiSeq測序和數(shù)據(jù)分析

將PCR產(chǎn)物純化和熒光定量后，構(gòu)建MiSeq文庫并進(jìn)行雙端測序，測序讀長300 bp。MiSeq測序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，得到優(yōu)化序列。采用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司I-Sanger云平臺進(jìn)行在線數(shù)據(jù)分析。采用Usearch進(jìn)行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析，對于相似性水平大于等于97%的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)，其中每個(gè)OTU代表一個(gè)物種[30]。采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，在各個(gè)分類水平統(tǒng)計(jì)樣本群落的組成。利用Mothur軟件計(jì)算樣本的α多樣性，包括Chao 1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Coverage值，以表征真菌群落的豐富度和多樣性。采用Qiime軟件計(jì)算樣本β多樣性距離矩陣，使用非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic mean，UPGMA）算法構(gòu)建樹狀結(jié)構(gòu)。

1.3.4 樣本序列的提交及序列號

將本研究中48 個(gè)fastq序列文件提交到美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）SRA數(shù)據(jù)庫（https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/sra），序列號為PRJNA534371。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果和α多樣性分析

通過Illumina MiSeq高通量測序，24 份大頭菜發(fā)酵液樣品共獲得1 299 970 條優(yōu)化序列，平均長度234.4～313.5 bp（表1）。去除無重復(fù)的單序列和嵌合體后，共獲得1 272 007 條有效序列。經(jīng)OTU分析，這些序列歸屬于4 個(gè)門、19 個(gè)綱、56 個(gè)目、106 個(gè)科、190 個(gè)屬、303 個(gè)種、516 個(gè)OTU。為保證樣本測序序列的均一性，對所有樣品有效序列按最小樣本序列數(shù)進(jìn)行抽平（每個(gè)樣本30 774 條有效序列）。抽平后，所有樣品序列歸屬于4 個(gè)門、18 個(gè)綱、50 個(gè)目、99 個(gè)科、175 個(gè)屬、284 個(gè)種、483 個(gè)OTU，每個(gè)樣品的OTU分類信息見表1。

表1 樣品信息Table 1 Fungal community composition and OTUs identified in samples

Chao 1指數(shù)和ACE指數(shù)以映群落的豐富度，Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Coverage值以映群落多樣性。每個(gè)樣品的Coverage值均為0.998以上，表明測序深度良好，覆蓋率高，可以真實(shí)展示樣品中的絕大多數(shù)真菌（表2）。在樣品1_1和1_2中，Chao 1指數(shù)和ACE指數(shù)較高，表明樣品中群落的豐富度較高。而隨著發(fā)酵的進(jìn)行，Chao 1指數(shù)和ACE指數(shù)明顯下降，而在1_8中又有所提高。分析Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)在各樣品中的變化可知，群落多樣性也呈現(xiàn)出相似的趨勢。這可能是由于發(fā)酵前期加入的食鹽相對較少，所以樣品中真菌群落的豐富度和多樣性較高，而隨著發(fā)酵的進(jìn)行，食鹽的添加量逐漸提高，導(dǎo)致不耐鹽的真菌逐漸消失，所以真菌群落的豐富度和多樣性有所下降。而在發(fā)酵的最后時(shí)期，真菌群落的豐富度和多樣性又有所提高，推測可能是有些真菌逐漸適應(yīng)了高鹽的環(huán)境，所以提高了真菌群落的豐富度和多樣性。

表2 α多樣性指數(shù)分析Table 2 α Diversity indices

2.2 不同發(fā)酵時(shí)期大頭菜發(fā)酵液樣本真菌群落結(jié)構(gòu)分析

在對大頭菜發(fā)酵液中不同分類學(xué)水平真菌菌群相對豐度進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用樣本層級聚類分析和主成分分析（principal component analysis，PCA）研究不同樣本真菌群落結(jié)構(gòu)的相似性和差異關(guān)系。在OTU分類水平上，采用bray-curtis距離算法，根據(jù)β多樣性距離矩陣進(jìn)行層級聚類分析，使用UPGMA算法構(gòu)建樹狀結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖1所示。24 個(gè)大頭菜發(fā)酵液樣品可聚為3 類，其中1_1和1_2的6 個(gè)樣品聚為一類，1_3、1_4、1_5的9 個(gè)樣品和1_6a聚為一類，1_7、1_8的6 個(gè)樣品和1_6b、1_6c聚為一類。由此也可將整個(gè)發(fā)酵過程大致分為3 個(gè)階段，發(fā)酵前期、中期和后期。在發(fā)酵的相同階段，真菌群落組成結(jié)構(gòu)相似。

圖1 OTU水平上樣本真菌群落聚類分析Fig. 1 Cluster analysis of fungal communities of the samples at the OTU level

進(jìn)一步PCA可知，不同樣本真菌群落結(jié)構(gòu)信息主要集中在前3 個(gè)主成分，其累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為93.14%，其中PC1的貢獻(xiàn)率為53.01%，PC2的貢獻(xiàn)率為26.6%。如圖2所示，樣本之間的距離代表真菌群落結(jié)構(gòu)的差異程度。24 個(gè)大頭菜發(fā)酵液樣本呈現(xiàn)出明顯的聚類趨勢，除1_6a與II類有交叉外，1_1和1_2聚為I類，1_3、1_4和1_5聚為II類，1_6、1_7和1_8聚為III類，這與UPGMA聚類分析結(jié)果一致。

圖2 OTU水平上樣本真菌群落PCAFig. 2 Principal component analysis of fungal communities at the OTU level

2.3 門水平真菌群落組成分析

如圖3所示，去除未分類的真菌后，樣品中真菌群落包含3 個(gè)門，分別為子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）和接合菌門（Zygomycota）。其中子囊菌門為優(yōu)勢菌門，相對豐度為74.2%～99.8%。其次為擔(dān)子菌門，相對豐度為0.25%～25.7%。擔(dān)子菌門在前期和后期相對豐度較高，在中期較低。在所有樣品中接合菌門相對豐度最低，在0.2%以下。

圖3 門水平上真菌群落組成分析Fig. 3 Fungal community composition at the phylum level

2.4 目水平真菌群落組成分析

不同發(fā)酵時(shí)期大頭菜樣品在目水平的真菌群落組成如圖4所示，主要?dú)w屬于11 個(gè)菌目，包括酵母目（Saccharomycetales）、炭角菌目（Xylariales）、散囊菌目（Eurotiales）、肉座菌目（Hypocreales）、格孢菌目（Pleosporales）、煤炱目（Capnodiales）、銀耳目（Tremellales）、Cystofilobasidiales、節(jié)擔(dān)菌目、norank_c__Sordariomycetes和傘型束梗孢菌目（Agaricostilbales），其他菌目相對豐度均為1%以下。

在1_1和1_2中，炭角菌目為優(yōu)勢菌目，相對豐度分別為60.2%和45.7%（平均值，下同），酵母目相對豐度僅為0.00%和0.07%。而在后續(xù)發(fā)酵過程中，酵母目取代炭角菌目，占據(jù)絕對優(yōu)勢，相對豐度達(dá)到了63.6%～99.5%。在1_1中，銀耳目相對豐度較高，為17.0%，而在1_2～1_4中降為3%以下，在1_5～1_8中降至1%以下。在整個(gè)發(fā)酵過程中，Cystofilobasidiales在1_1中相對豐度最高，為8.4%，其次為1_4中（2.1%），在其他6 個(gè)發(fā)酵時(shí)期相對豐度均在1%以下。

圖4 目水平上真菌群落組成分析Fig. 4 Fungal community composition at the order level

2.5 屬水平真菌群落組成分析

對屬水平總豐度排在前30的物種進(jìn)行層級聚類，采用平均聚類方式，得到如圖5所示的群落組成熱圖。圖5表明了襄陽大頭菜不同發(fā)酵時(shí)期樣本間不同真菌菌屬的相對豐度以及真菌組成的差異性和和樣品間的相似性。在1_1和1_2中，明梭孢屬（Monographella）為優(yōu)勢菌屬，相對豐度分別為60.1%和45.6%。在1_3～1_5中，德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）占據(jù)了絕對的優(yōu)勢，相對豐度達(dá)到63.5%～96.3%。而在1_6～1_8中，接合酵母屬（Zygosaccharomyces）相對豐度大大提高，發(fā)展為優(yōu)勢菌屬，德巴利氏酵母屬相對豐度有較大幅度的下降，在1_7中接合酵母屬相對豐度超過德巴利氏酵母屬，成為相對豐度最高的菌屬（86.5%）。

由圖5可知，整個(gè)發(fā)酵過程樣品可聚為3 類，1_1和1_2在屬水平真菌群落結(jié)構(gòu)比較接近，歸為一類，1_3、1_4和1_5歸為一類，1_6、1_7和1_8歸為一類，分別對應(yīng)于發(fā)酵的前期、中期和后期，這與聚類分析和PCA結(jié)果一致?？傌S度排在前30的菌屬可聚為5 類，接合酵母屬和德巴利氏酵母屬聚為一類，在發(fā)酵前期豐度較低，而在發(fā)酵中后期豐度較高；赤霉菌屬（Gibberella）、unclassified_f__Trichocomaceae、鏈格孢屬（Alternaria）、Cystofilobasidium、Hannaella、Dioszegia、隱球菌屬（Cryptococcus）和鐮刀菌屬（Fusarium）聚為一類，在發(fā)酵前期和中期相對豐度較高，而在發(fā)酵后期相對豐度較低。

圖5 屬水平上真菌群落組成熱圖Fig. 5 Heatmap of fungal communities at the genus level

2.6 不同發(fā)酵階段OTU Venn圖分析

圖6 3 個(gè)發(fā)酵階段真菌群落OTU水平的Venn圖Fig. 6 Venn diagram analysis of fungal communities at the OTU level in the samples from three fermentation stages

利用Venn圖統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣本中共有的和獨(dú)有的OTU的數(shù)量，可以直觀地顯示出不同分類水平樣本的組成相似性和重疊程度。24 個(gè)大頭菜發(fā)酵液樣本中共檢出483 個(gè)OTU，發(fā)酵前期OTU數(shù)量最多，達(dá)到329 個(gè)，其次為發(fā)酵中期（266 個(gè)），發(fā)酵后期樣本中OTU數(shù)量最少，為246 個(gè)。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，OTU數(shù)量有所降低，這可能是由于在發(fā)酵過程中逐步加入了大量的食鹽，抑制了不耐鹽真菌的生長。從圖6可以看出，3 個(gè)發(fā)酵階段共有OTU數(shù)為124 個(gè)，發(fā)酵前期、中期和后期特有OTU數(shù)分別為118、58 個(gè)和73 個(gè)，分別占各發(fā)酵階段總OTU數(shù)的35.87%、21.80%和29.67%。

3 結(jié) 論

采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對發(fā)酵過程中傳統(tǒng)發(fā)酵大頭菜的真菌多樣性和菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，經(jīng)OTU分類學(xué)分析，24 份樣本中共發(fā)現(xiàn)4 個(gè)門、19 個(gè)綱、56 個(gè)目、106 個(gè)科、190 個(gè)屬、303 個(gè)種、516 個(gè)OTU。α多樣性分析表明，在整個(gè)發(fā)酵過程中，前期真菌群落的豐富度和多樣性更高。通過聚類分析和PCA發(fā)現(xiàn)，24 個(gè)樣品可根據(jù)微生物群落結(jié)構(gòu)特征劃分為3 個(gè)聚類，將發(fā)酵的整個(gè)過程分為發(fā)酵前期、中期和后期，3 個(gè)發(fā)酵階段共有OTU數(shù)為124 個(gè)。去除未分類的真菌后，子囊菌門為優(yōu)勢菌門，相對豐度為74.2%～99.8%。目水平上，發(fā)酵前期炭角菌目為優(yōu)勢菌目，相對豐度為45.7%～60.2%，后續(xù)發(fā)酵過程中，酵母目取代炭角菌目，占據(jù)絕對優(yōu)勢，相對豐度達(dá)到63.6%～99.5%。屬水平上，發(fā)酵前期明梭孢屬為優(yōu)勢菌屬，相對豐度為45.6%～60.1%。發(fā)酵中期，德巴利氏酵母屬占據(jù)了絕對的優(yōu)勢，相對豐度達(dá)到63.5%～96.3%。而在發(fā)酵后期，接合酵母屬相對豐度大大提高，發(fā)展為優(yōu)勢菌屬，甚至超過德巴利氏酵母屬。本研究全面揭示了傳統(tǒng)發(fā)酵大頭菜發(fā)酵過程中真菌群落結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化，可為后續(xù)大頭菜發(fā)酵劑的制備提供一定理論基礎(chǔ)，對今后傳統(tǒng)發(fā)酵大頭菜的工業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)具有極其重要的意義。