楊恒強(qiáng)

（江蘇省蘇州市動(dòng)物園 215009）

弓形蟲(chóng)是一種寄生蟲(chóng)感染疾病，屬于人畜共患病，因此不僅影響了動(dòng)物的正常生長(zhǎng)，也對(duì)人類(lèi)的健康產(chǎn)生了嚴(yán)重的威脅。弓形蟲(chóng)屬球蟲(chóng)亞綱，弓形體屬，細(xì)胞內(nèi)寄生蟲(chóng)，中間宿主包括鳥(niǎo)類(lèi)、昆蟲(chóng)類(lèi)、爬蟲(chóng)類(lèi)、魚(yú)類(lèi)以及哺乳動(dòng)物，最終宿主為貓科動(dòng)物。弓形蟲(chóng)在細(xì)胞內(nèi)寄生，隨著細(xì)胞在血液中流動(dòng)，弓形蟲(chóng)也會(huì)到達(dá)宿主體內(nèi)的各處部位，并對(duì)機(jī)體組織進(jìn)行破壞，最終導(dǎo)致宿主的免疫機(jī)能下降，患病率增高，發(fā)病率增高[1]。動(dòng)物園中的野生動(dòng)物為圈養(yǎng)的飼養(yǎng)模式，容易造成弓形蟲(chóng)病的傳播擴(kuò)散，因此，開(kāi)展圈養(yǎng)野生動(dòng)物弓形蟲(chóng)感染情況調(diào)查的意義重大。對(duì)于圈養(yǎng)野生動(dòng)物弓形蟲(chóng)病調(diào)查與研究的主要內(nèi)容，包括感染情況、弓形蟲(chóng)毒力分析等，詳盡的研究報(bào)告能夠?yàn)槿︷B(yǎng)野生動(dòng)物弓形蟲(chóng)病的綜合防治措施起到了一定的指導(dǎo)意義，最大限度地降低了弓形蟲(chóng)病對(duì)圈養(yǎng)野生動(dòng)物的危害。

1 研究圈養(yǎng)野生動(dòng)物弓形蟲(chóng)感染的意義

現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)動(dòng)物園的總數(shù)量大約在200 家左右，但對(duì)圈養(yǎng)野生動(dòng)物感染弓形蟲(chóng)方面的研究尚不完善，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)報(bào)道，國(guó)內(nèi)北京、上海、成都、福州等城市均有不同程度的圈養(yǎng)野生動(dòng)物受到弓形蟲(chóng)感染，甚至黑龍江的東北虎養(yǎng)殖基地、成都的大熊貓繁殖基地都曾發(fā)現(xiàn)過(guò)弓形蟲(chóng)感染的情況。由于多家動(dòng)物園甚至是重點(diǎn)動(dòng)物保護(hù)區(qū)都發(fā)生過(guò)弓形蟲(chóng)感染的案例，并且野生動(dòng)物受到弓形蟲(chóng)感染后多數(shù)為慢性感染，從體態(tài)癥狀上沒(méi)有明顯異常癥狀，但隨著慢性感染時(shí)間的遞增，弓形蟲(chóng)在野生動(dòng)物體內(nèi)大量繁殖，會(huì)造成嚴(yán)重的危害。在慢性感染階段由于沒(méi)有明顯患病癥狀，針對(duì)弓形蟲(chóng)感染方面的診斷難度倍增，這也是弓形蟲(chóng)在圈養(yǎng)區(qū)域大面積傳染的原因[2]。針對(duì)圈養(yǎng)野生動(dòng)物弓形蟲(chóng)感染的現(xiàn)狀，為保證圈養(yǎng)野生動(dòng)物的健康安全，確保野生動(dòng)物在圈養(yǎng)區(qū)域健康生長(zhǎng)，對(duì)圈養(yǎng)野生動(dòng)物弓形蟲(chóng)感染的研究迫在眉睫。

2 試驗(yàn)與方法

2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本次試驗(yàn)時(shí)間為2017 年6 月～2019 年6 月，在動(dòng)物園采集血液樣本，使用間接酶聯(lián)免疫試驗(yàn)法檢測(cè)樣本野生動(dòng)物的弓形蟲(chóng)感染情況，樣本包含30 種野生動(dòng)物共120 份血液樣本，其中哺乳綱食草動(dòng)物60 份、食肉動(dòng)物40 份、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物5 份、禽類(lèi)動(dòng)物15 份（參見(jiàn)附圖）。采集到的血液樣品要置于-20℃的恒溫冰箱中保存待用。

2.2 試驗(yàn)方法

附圖 各品種樣本數(shù)量

采集圈養(yǎng)野生動(dòng)物的血液樣本，并做好標(biāo)記序號(hào)，使用空白96 孔板對(duì)樣本進(jìn)行稀釋?zhuān)♂尡壤凑?：10 進(jìn)行。使用蒸餾水將濃縮洗滌劑稀釋?zhuān)♂尡稊?shù)為1:20 倍數(shù)，制成稀釋洗滌劑，然后進(jìn)行洗滌液的準(zhǔn)備，按照每份樣本每次洗板300ml的計(jì)量，進(jìn)行2 次洗板共計(jì)需要600ml 的稀釋液，根據(jù)樣本的數(shù)量進(jìn)行合理的配比，避免過(guò)量浪費(fèi)。然后將樣本置于21℃恒溫下培養(yǎng)45min 后，進(jìn)行洗板處理，一共需要經(jīng)過(guò)3 次洗板，在此過(guò)程中動(dòng)作要慢避免稀釋液流速過(guò)快造成孔板上的實(shí)驗(yàn)樣本受損，影響實(shí)驗(yàn)效果。同時(shí)需要注意的是，在最后一次進(jìn)行洗滌液沖洗后，需要將剩余的稀釋液用衛(wèi)生棉吸去，使用連續(xù)加液器加液。然后再次對(duì)樣本進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度保持在16～26℃，持續(xù)30min，進(jìn)行第二次洗板，同樣進(jìn)行3 次。隨后在孔板的每個(gè)孔內(nèi)加入底物，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)15min，加入終止液。使用酶標(biāo)儀讀取培養(yǎng)物波長(zhǎng)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用450nm 的波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，分別記錄。將酶標(biāo)儀記錄的數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算每組樣本的S/P 值，若S/P 值＞50%，則結(jié)果為陽(yáng)性；若S/P值≤40%則為陽(yáng)性；若S/P 值非兩者，處于兩者之間，則結(jié)果仍存疑。

3 結(jié)果及分析

由附表可知，本次試驗(yàn)檢測(cè)的120 份野生動(dòng)物血液樣本中，總體弓形蟲(chóng)陽(yáng)性率為23.3% (28/120)，其中食草性動(dòng)物弓形蟲(chóng)陽(yáng)性率最高，達(dá)到了35.0% (21/60)，食肉性動(dòng)物弓形蟲(chóng)陽(yáng)性率為15.0% (6/40)，靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物弓形蟲(chóng)陽(yáng)性率為20.0% (1/5)，禽類(lèi)動(dòng)物未檢測(cè)到陽(yáng)性抗體(0/15)。

4 討論與分析

4.1 結(jié)果分析

通常野生動(dòng)物在感染了弓形蟲(chóng)1～2 周后，檢測(cè)結(jié)果顯示為陽(yáng)性，感染3～5 周后抗體效價(jià)會(huì)達(dá)到峰值，并且在很長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)保持不變。目前針對(duì)野生動(dòng)物弓形蟲(chóng)抗體的檢測(cè)，主要采取凝集檢測(cè)法(MAT)、間接紅細(xì)胞凝集檢測(cè)法(IHAT) 和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)法(ELISA) 等[3]。張述義等[4]在2001 年對(duì)凝集檢測(cè)法(MAT)、間接紅細(xì)胞凝集檢測(cè)法(IHAT) 和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)法(ELISA) 3 種檢測(cè)方法的陽(yáng)性檢出率進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果顯示，3 種檢測(cè)方法得到的結(jié)果無(wú)顯著差異，均適用于野生動(dòng)物弓形蟲(chóng)感染的流行病學(xué)調(diào)查。

在本次試驗(yàn)中，使用的檢測(cè)方法是酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)法(ELISA)，檢測(cè)結(jié)果顯示動(dòng)物園中120 份野生動(dòng)物的血液樣本陽(yáng)性率為23.3%。其中，食草性野生動(dòng)物的感染率最高，為35.0%，這可能與動(dòng)物園的布局有關(guān)，食草性野生動(dòng)物的場(chǎng)館通常為半開(kāi)放式，沒(méi)有設(shè)置隔離網(wǎng)等設(shè)施，與外界接觸的頻率較高，而且動(dòng)物園周?chē)辛骼素埖拇嬖?，這種半開(kāi)放式的布局對(duì)流浪貓沒(méi)有防護(hù)作用，時(shí)常有流浪貓?jiān)谑巢菪砸吧鷦?dòng)物區(qū)域活動(dòng)，而弓形蟲(chóng)是貓的常見(jiàn)病，且貓科動(dòng)物是弓形蟲(chóng)的終宿主，流浪貓沒(méi)有經(jīng)過(guò)驅(qū)蟲(chóng)處理，極易攜帶弓形蟲(chóng)，通過(guò)糞便使弓形蟲(chóng)在動(dòng)物園中傳播，草食性動(dòng)物誤食含有弓形蟲(chóng)卵囊的糞便而發(fā)生感染。根據(jù)資料顯示，動(dòng)物園附近流浪貓弓形蟲(chóng)的抗體陽(yáng)性率高達(dá)50%。對(duì)于禽類(lèi)弓形蟲(chóng)感染的檢測(cè)，不同的地區(qū)，不同動(dòng)物園內(nèi)的結(jié)果差異較大，本次試驗(yàn)中，采集了15各血液樣本對(duì)禽類(lèi)野生動(dòng)物弓形蟲(chóng)感染情況進(jìn)行檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)有陽(yáng)性禽類(lèi)動(dòng)物，出現(xiàn)此檢測(cè)結(jié)果的主要原因可能是采集的樣本為弓形蟲(chóng)的不易感物種，且檢測(cè)數(shù)量較少，未輻射大多數(shù)的禽類(lèi)野生動(dòng)物。

附表 野生動(dòng)物弓形蟲(chóng)血清學(xué)抗體檢測(cè)結(jié)果

4.2 討論

根據(jù)本次試驗(yàn)可知，動(dòng)物園內(nèi)野生動(dòng)物感染弓形蟲(chóng)的陽(yáng)性率并不低，在日常的飼養(yǎng)中，需要加以防控，首先要控制流浪貓的數(shù)量，優(yōu)化動(dòng)物園內(nèi)的布局，減少流浪貓與野生動(dòng)物的接觸，同時(shí)，對(duì)于檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的野生動(dòng)物，要采取驅(qū)蟲(chóng)的措施，減少動(dòng)物園內(nèi)的感染數(shù)量，加強(qiáng)消毒管理，切斷弓形蟲(chóng)的傳播途徑，保證野生動(dòng)物的安全與健康[5]。感染過(guò)弓形蟲(chóng)的動(dòng)物即使經(jīng)過(guò)治療也容易成為隱性帶蟲(chóng)動(dòng)物，危害動(dòng)物園中其他野生動(dòng)物的健康，所以，預(yù)防動(dòng)物園中的交叉感染以及重復(fù)感染是防控的關(guān)鍵[6]。