劉丹 陳楊 劉盛均（通訊作者）

（綿陽市中心醫(yī)院病理科 四川 綿陽 621000）

免疫組化技術(shù)在病理診斷中起著十分重要的作用，免疫組化陽性對(duì)照，廣泛應(yīng)用于病理科進(jìn)行免疫組化的質(zhì)量控制，以驗(yàn)證免疫組化制片中，試劑的有效性、程序的準(zhǔn)確性。目前，病理科主要應(yīng)用單組織陽性對(duì)照、多組織陽性對(duì)照[1]或組織芯片[2]來進(jìn)行質(zhì)量控制，存在準(zhǔn)備周期長(zhǎng)、適用范圍窄、操作繁瑣等缺陷。我科自2017年來，應(yīng)用以液基細(xì)胞學(xué)原理的免疫組化陽性對(duì)照，配置簡(jiǎn)單、對(duì)照譜廣、有效期長(zhǎng)，現(xiàn)介紹如下。

1.材料

病理組織，塑料離心管，二甲苯，環(huán)保透明劑，95%乙醇，組織包埋模、包埋盒、包埋機(jī)，斜角式低速離心機(jī)、病理切片機(jī)。

2.方法

2.1 于日常工作中，留取以下組織按下表分組編號(hào)[3-4]，常規(guī)病理固定、脫水、透明、浸蠟、包埋，存2-8℃冰箱備用（注意：乳腺癌和胃癌組織Her-2 0-3+的都需準(zhǔn)備）。部分少見組織可選取經(jīng)免疫組化診斷證實(shí)的病例蠟塊，以手術(shù)刀切取適量組織重新包埋。

1 2 3 4 A治療相關(guān) 乳腺癌（Her-2 0-3+） 胃腺癌（Her-2 0-3+） 胃GIST子宮內(nèi)膜B上皮組織 肺鱗癌 肺腺癌 闌尾 前列腺C淋巴組織 扁桃體 胸腺 何杰金 腎上腺D軟組織 腦組織 闌尾 骨骼肌 黑色素瘤

2.2 根據(jù)分組，取4枚包埋模分別標(biāo)記A、B、C、D。將各組1、2、3、4號(hào)蠟塊分別連續(xù)切片20張，根據(jù)各蠟塊內(nèi)組織大小，可適當(dāng)增減，使所切組織量較一致。將組織片按分組放于包埋模內(nèi)，以鑷子適當(dāng)壓實(shí)。

2.3 盛有組織的包埋模放入病理組織包埋機(jī)儲(chǔ)存盒內(nèi)，65℃存放20分鐘。石蠟完全融化后，以熱鑷子略攪拌混合物，取出包埋模，室溫放置1分鐘。包埋模內(nèi)分別放入已編號(hào)A、B、C、D的包埋盒底，添加石蠟完成再次包埋。

2.4 冷凍A、B、C、D四個(gè)蠟塊，切片機(jī)修出組織最大面。以3um厚度連續(xù)切片，將組織片按分組放入已編號(hào)ABCD的塑料離心管。

2.5 各離心管滴加二甲苯至10ml，蓋上管蓋，震蕩至石蠟完全溶解。2000r/m離心3分鐘。上清液倒入廢液收集容器。分別滴加環(huán)保透明劑至10ml，震蕩混勻，2000r/m離心3分鐘。棄去上清液。滴加95%乙醇至10ml，震蕩混勻。取5只50ml滴管瓶，分別編號(hào)A、B、C、D、E。將細(xì)胞混懸液分別倒入相應(yīng)編號(hào)瓶中，添加95%乙醇至50ml。混勻后A、B、C、D瓶各吸取10ml至E瓶。放入2～8℃冰箱冷藏備用。

2.6 使用時(shí)，根據(jù)抗體標(biāo)記物，可選用ABCD之一作陽性對(duì)照，也可選用E瓶作廣譜陽性對(duì)照。在免疫組化白片組織邊緣，以免疫組化油筆畫直徑約0.5cm圈，將選用的陽性對(duì)照細(xì)胞懸液搖勻，滴加一滴于圈內(nèi)。自然風(fēng)干或放入65攝氏度烤箱5分鐘。即可進(jìn)行手工及機(jī)器進(jìn)行免疫組化染色。

3.結(jié)果

陽性對(duì)照染色理想，不同抗體在不同組織中具有不同的染色強(qiáng)度和定位（如圖①-④），且受測(cè)組織和對(duì)照在用一張載玻片上，在相同條件下進(jìn)行染色，保證了實(shí)驗(yàn)條件的一致性，能起到實(shí)時(shí)有效的免疫組化質(zhì)量監(jiān)控，便于診斷醫(yī)生做出更可靠的判斷和“問題”染色的分析提供有力依據(jù)。

4.討論

4.1 液基細(xì)胞學(xué)原理制作的免疫組化廣譜陽性對(duì)照與單組織陽性對(duì)照比較，具有覆蓋面廣，有效期長(zhǎng)，不需要準(zhǔn)備大量用于標(biāo)記各種類型的組織蠟塊的優(yōu)勢(shì)，且包含高表達(dá)、低表達(dá)及不表達(dá)目的抗原的對(duì)照組織，對(duì)于需要定量分析的抗體如Her-2的判讀更為精確標(biāo)準(zhǔn)。

4.2 與多組織陽性對(duì)照比較，（1）多組織陽性對(duì)照的組織蠟塊和石蠟切片不易長(zhǎng)期保存，因存放時(shí)間過長(zhǎng)，組織抗原的保存受到一定的影響，抗原活性會(huì)有所降低，因此組織蠟塊保存數(shù)月后應(yīng)放棄使用，重新找新的組織制作蠟塊。（2）對(duì)照備用切片的制備，一次不易大量切片導(dǎo)致過長(zhǎng)時(shí)間保存，一般準(zhǔn)備一個(gè)星期使用量為佳，所以每周需要花大量時(shí)間準(zhǔn)備對(duì)照備用片。（3）同一組織塊連續(xù)切片不能保證每張切片都有需要的目的抗原。而液基細(xì)胞學(xué)原理制作的免疫組化廣譜陽性對(duì)照可很好的避免了這些缺點(diǎn)。

4.3 與組織芯片比較液基細(xì)胞學(xué)原理制作的免疫組化廣譜陽性對(duì)照，操作簡(jiǎn)單，制作過程要求低，成本及便利性提高，有利于日常操作。