王 蔚，杜 淵，王洪連，孫長偵，王 麗，白 雪，楊思進

（西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000）

腦出血是內(nèi)科臨床常見的危急重癥，發(fā)病急，轉(zhuǎn)變快，急性期嚴重威脅患者生命安全，患病后又往往留有不同程度的后遺癥，給患者的生活質(zhì)量造成不良影響，由此帶來巨大的社會和家庭經(jīng)濟負擔。研究表明，諸多炎性因子參與了腦出血的發(fā)病過程，且與疾病的預后密切相關(guān)［1-2］。腦出血屬中醫(yī)學“中風病”范疇，蛭龍活血通瘀膠囊是我院研制的院內(nèi)中成藥復方制劑，該藥廣泛用于中風患者的防治，取得了滿意療效［3］。本實驗通過觀察蛭龍活血通瘀膠囊對腦出血大鼠腦組織病理形態(tài)和血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1（IL-1）及白細胞介素6（IL-6）的影響，探討該藥防治腦出血的有效作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物 清潔級健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量260～300 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，實驗動物使用許可證號為SCXK（川）2015-030。飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學實驗動物研究中心，環(huán)境溫度22±2℃，濕度30%～40%，普通大鼠飼料喂養(yǎng)，自由攝食及飲水。

1.2 藥物 蛭龍活血通瘀膠囊由黃芪、水蛭、地龍、大血藤、桂枝等藥物組成，規(guī)格為每粒0.4 g（相當于含生藥2.625 g），由西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，批號20180216；鹽酸法舒地爾注射液（規(guī)格為每支2 ml∶30 mg，批號180101，成都菀東藥業(yè)有限公司生產(chǎn)）；TNF-α、IL-1及IL-6 ELISA檢測試劑盒均為上海優(yōu)選生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 儀器 大鼠腦立體定位儀（北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司）；ATPB457A小動物電子稱（深圳安普特電子科技有限公司）；BSA224S精密電子天平；cx21FS1光學顯微照相系統(tǒng)（日本Olympus公司）；國產(chǎn)BMZ-3型自動組織包埋機（湖北安立信醫(yī)療實業(yè)有限公司）；德國Leica石蠟切片機（北京科譽興業(yè)科技發(fā)展有限公司）；infinite F50酶標儀（奧地利Tecan）；TDZ5-WS醫(yī)用離心機（長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機儀器有限公司）。

2 方 法

2.1 分組與造模 將40只大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、腦出血模型組、蛭龍活血通瘀組、鹽酸法舒地爾組，每組10只。實驗大鼠術(shù)前稱重，按照0.4 g/kg給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，剪斷鼠尾取自體血50μl。將大鼠以俯臥位固定于立體定位儀上，頭部進行備皮消毒以暴露手術(shù)區(qū)域，縱行切開頭皮正中約10 mm，用30%雙氧水腐蝕骨膜，暴露前囟和冠狀縫，參照ROSENBER［4］的方法，根據(jù)《腦立體定位圖譜》［5］定位尾殼核區(qū)域，調(diào)整微量進樣器使針尖垂直于矢狀縫右側(cè)旁開3.0 mm，前囟前0.2 mm處，用三棱針在針尖下方鉆孔，深度達硬腦膜表面，以顱骨外板為零點進針6.0 mm，以5μl/min緩慢勻速將血注入腦內(nèi)，留針約15 min后緩慢退針，骨蠟封閉鉆孔，縫合頭皮并常規(guī)消毒。假手術(shù)組術(shù)中只進針，不注血。采用ZEA LONGA 的“5分制法”［6］進行術(shù)后大鼠神經(jīng)功能缺損評分，造模成功的大鼠（評分為1～3分）納入實驗。

2.2 給藥 蛭龍活血通瘀組采用灌胃給藥，每日1.2 g/kg（按成人60 kg用量為3.6 g/d計算，大鼠為人體用量20倍），灌胃體積為3 ml；鹽酸法舒地爾組采用腹腔注射給藥，每日12 mg/kg（按成人60 kg用量為90 mg/d計算）［7］；假手術(shù)組和腦出血模型組均給予等體積的生理鹽水灌胃。

2.3 觀察指標

2.3.1 腦組織病理形態(tài) 各組大鼠術(shù)后3 d給予深度麻醉，用0.9%生理鹽水、4%多聚甲醛依次行心臟灌注，快速剪斷鼠頭，剝?nèi)〈竽X，冠狀位切取針孔處含血腫的腦組織，浸泡于4%多聚甲醛中，固定24 h后給予由低到高梯度的乙醇脫水，二甲苯透明，用石蠟包埋制成蠟塊，用切片機切片，約為5μm厚度，展片、撈片、烤片，經(jīng)二甲苯脫蠟，依次由高到低梯度乙醇浸泡，蒸餾水洗，蘇木青染色后水洗，鹽酸乙醇浸泡后水洗，弱氨水返藍，伊紅染色后水洗，再由低到高梯度乙醇脫水，二甲苯透明，干燥后用中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察血腫周圍腦組織病理學改變。

2.3.2 血清中TNF-α、IL-1及IL-6的含量 各組大鼠術(shù)后3 d給予深度麻醉，仰臥位放在操作臺上，剪開胸腔暴露心臟，用采血針經(jīng)心臟采血3～5 ml于采血管中，靜置2 h后，放入離心機，以3 000 r/min離心10 min，然后分離血清置于-20℃冰箱存放備檢。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）對大鼠血清TNF-α、IL-1及IL-6進行檢測，檢測過程嚴格按照各試劑盒使用說明書的要求完成。

2.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析（One-way ANOVA），LSD及Dunnett法作多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 各組血腫周圍腦組織HE染色比較 假手術(shù)組：血腫周圍腦組織結(jié)構(gòu)清晰、完整，神經(jīng)細胞胞體規(guī)律排列，胞漿染色均勻，無明顯腫脹；腦出血模型組：血腫周圍腦組織呈明顯水腫，細胞核固縮，廣泛液化，細胞間隙結(jié)構(gòu)紊亂，血管周圍的空隙增大，組織結(jié)構(gòu)疏松，局部有出血，炎性細胞浸潤及膠質(zhì)細胞增生；與腦出血模型組比較，蛭龍活血通瘀組和鹽酸法舒地爾組的血腫周圍腦組織水腫程度明顯減輕，細胞層次也較清楚，神經(jīng)細胞液化、壞死等均有所減輕，病理形態(tài)得到明顯改善。見圖1。

圖1 各組血腫周圍腦組織HE染色比較（×400）

3.2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1及IL-6的含量比較 見表1。與假手術(shù)組比較，腦出血模型組大鼠血清TNF-α、IL-1及IL-6的含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與腦出血模型組比較，蛭龍活血通瘀組、鹽酸法舒地爾組大鼠血清TNF-α、IL-1及IL-6的含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；蛭龍活血通瘀組和鹽酸法舒地爾組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1及IL-6的含量比較 （pg/ml，x±s）

4 討 論

腦出血后造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷和功能障礙的機制尚未完全明確，但血腫周圍腦水腫形成是影響腦出血后病情轉(zhuǎn)歸和預后的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而炎性反應在其中產(chǎn)生了重要作用。喻明等［8］研究表明，腦出血后機體的適度炎性反應對血腫吸收和壞死組織清除具有一定的作用，而一旦炎性反應過度則會導致并加重腦水腫，影響出血區(qū)的腦血流量，增加血-腦脊液屏障通透性，使其結(jié)構(gòu)破壞進而導致腦組織一系列繼發(fā)性損傷。白細胞在病區(qū)局部聚集和黏附是炎性反應的重要標志，其中包括中性粒細胞的浸潤，由此釋放多種炎性因子，如TNF-α、IL-6等。這些由免疫細胞產(chǎn)生的小分子多肽具有很高的免疫活性，能介導調(diào)節(jié)免疫反應、機體代謝和炎性反應。研究證實，炎性因子在腦出血病理生理機制中具有重要作用［9］，在急性腦出血中能夠激活、介導腦組織的繼發(fā)性損傷。

炎性因子中TNF-α屬于前炎性因子，是機體炎性反應和免疫應答的重要調(diào)節(jié)因子，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中由小膠質(zhì)細胞及星形細胞分泌，通過激活血管內(nèi)皮細胞，促進血管收縮，影響血-腦脊液屏障通透性，并可使小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞變形腫脹，釋放大量氧自由基及興奮性氨基酸，與其他炎性因子如IL-1、IL-6協(xié)同作用，加重腦出血后腦水腫的發(fā)生［10］。IL-1是一類具有廣泛作用的多肽，其與細胞膜上IL-1受體相結(jié)合，通過G蛋白發(fā)揮作用。在腦組織中，IL-1主要參與T和B淋巴細胞的增殖和分化，刺激造血干細胞分化，參與炎性反應,亦是多形核白細胞的直接及間接趨化因子，引起血腫周圍聚集多形核細胞，炎癥介質(zhì)激活，誘導黏附分子合成及釋放，使腦組織損傷加重。IL-6是一種分子量約為26 KD的細胞因子，在腦組織受到損傷時，可由小膠質(zhì)細胞及星形膠質(zhì)細胞誘導產(chǎn)生，同時周圍血中分泌IL-6的白細胞數(shù)量也增多，從而使血清中IL-6含量升高，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成神經(jīng)毒性作用［11］。研究報道，腦出血患者在起病后3～4 d血腫周圍腦水腫的程度與起病24 h內(nèi)TNF-α的含量相關(guān)，腦出血患者血漿中TNF-α與IL-6水平于發(fā)病后3 d達到高峰,這與腦組織水腫及炎性反應最嚴重的時期相吻合,并且隨著病程的延長，腦水腫得到改善后TNF-α和IL-6的水平也有所下降［12-13］。

Ras同源基因/Rho相關(guān)螺旋卷曲蛋白激酶（Ras homolog gene/a Rho-associated coiled coil-forming protein kinase，Rho/ROCK）作為機體內(nèi)廣泛存在的一種信號傳遞通路，能夠介導腦出血后炎癥反應，影響血腦屏障通透性，與腦水腫密切相關(guān)，進而導致腦組織損傷。Rho激酶抑制劑通過抑制Rho激酶活性，可抑制炎性反應，抗血管痙攣及促進神經(jīng)損傷后修復，具有神經(jīng)保護作用，通過抑制該通路的激活，可抑制血管收縮和炎性因子的釋放［14］。鹽酸法舒地爾是一種新型的Rho激酶抑制劑，也是目前唯一一種應用于臨床的Rho激酶抑制劑，研究顯示，它可通過抑制磷酸化過程起到抑制炎性細胞遷移、浸潤，減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，減輕炎癥反應損傷，并可保護血-腦脊液屏障，減輕腦出血后腦水腫，促進腦損傷后神經(jīng)功能修復［15-17］。動物實驗證實，鹽酸法舒地爾可降低大鼠血清TNF-α、IL-6水平，減輕腦出血后的腦血管痙攣［18］。

蛭龍活血通瘀膠囊是我院常用的院內(nèi)制劑，被廣泛應用臨床心腦血管疾病的治療中，該藥全方具有益氣祛痰、活血化瘀、溫經(jīng)通絡(luò)、養(yǎng)血祛風之效［19］。前期的動物實驗表明［20-21］，該藥能改善腦出血大鼠神經(jīng)功能損傷評分，降低腦含水量，能明顯抑制缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）活化，促進蛋白酶激活受體-1（PAR-1）的表達，減少神經(jīng)細胞凋亡，對腦出血大鼠具有腦保護作用。為進一步探索蛭龍活血通瘀膠囊防治腦出血的作用機制，本研究以自體血制備腦出血實驗大鼠模型，以ROCK抑制劑鹽酸法舒地爾為陽性對照藥，觀察蛭龍活血通瘀膠囊對大鼠腦出血后血清炎性因子TNF-α、IL-1及IL-6水平的影響。結(jié)果表明，蛭龍活血通瘀膠囊能明顯改善腦出血大鼠腦組織病血腫周圍病理形態(tài)，可能與顯著降低腦出血大鼠血清TNF-α、IL-1及IL-6炎性因子的水平有關(guān)，但其機制是否與鹽酸法舒地爾通過抑制ROCK通路調(diào)節(jié)炎性因子的釋放相似，尚待進一步探索。