張興博，梁健芬，徐柳炎

（廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530021）

帕金森病（parkinson’s disease，PD）是以黑質多巴胺（dopamine，DA）能神經元缺失，胞內出現(xiàn)路易小體（lewy bodies，LBs）為主要病理特征的老年常見運動障礙疾病。PD的發(fā)生與線粒體功能缺陷、氧化應激、免疫異常、細胞凋亡等多種因素有關［1-4］，其中氧化應激反應增強是導致DA能神經元死亡的主要因素之一。迄今為止，PD的西醫(yī)治療仍以改善癥狀為主，不能阻止疾病進展，其治療包括藥物、外科手術以及處于研究階段的神經干細胞移植、基因治療等，但由于臨床上各種療法均存在不同程度的并發(fā)癥和副作用，嚴重影響了PD患者的生存質量。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)加味五虎追風散治療PD具有良好療效，可顯著改善患者的運動癥狀，而且與西藥合用還可降低西藥的副作用，從而提高患者生活質量。本研究以魚藤酮葵花油乳化液誘導建立PD大鼠模型，觀察加味五虎追風散對PD模型大鼠氧化應激反應的影響，以探討其治療PD的作用機制，為化痰息風療法治療PD提供科學依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物 健康Wistar大鼠45只，雄性，體質量200～230 g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK桂2009-0002。

1.2 試藥與試劑 加味五虎追風散：由蟬蛻6 g、天南星6 g、天麻12 g、全蝎3 g、僵蠶10 g、大地棕根15 g組成，以上中藥使用江蘇省江陰天江藥業(yè)有限公司的配方顆粒進行調劑，制成湯藥濃度為0.38 g/ml，備用。魚藤酮（Rotenone），貨號R8875，購自Sigma公司，使用時配制濃度為2 mg/ml，每天劑量為2 mg/kg。谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒，貨號：A005-1；谷胱甘肽（glutataione，GSH）試劑盒，貨號：A006-1-1；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒，貨號：A001-1；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒，貨號：A003-1-2；以上試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，編號：ZLI-9045；TH免疫組化試劑一抗、二抗購自武漢博士德生物工程有限公司，貨號：A14419。

2 實驗方法

2.1 動物分組與給藥 45只大鼠隨機分為正常組、模型組、加味五虎追風散組，每組15只。模型組及加味五虎追風散組按文獻［5］方法造模，均以2 mg/kg給藥劑量在大鼠頸背部皮下注射2 mg/ml的魚藤酮葵花油乳化液進行造模，每日1次，連續(xù)給藥4周。正常組同法注射予相同體積的葵花油乳液，造模結束后給予藥物干預，加味五虎追風散組每日灌胃給予10 ml/kg加味五虎追風散溶液，正常組、模型組每日給予等量的蒸餾水灌胃。參照CHEN等［6］行為學評分標準，1分：大鼠出現(xiàn)拒捕行為減弱、豎毛、毛色變黃變臟、弓背、主動活動減少；2分：有1分的表現(xiàn)，且主動活動減少明顯、動作遲緩，并有震顫或步態(tài)不穩(wěn)；4分：有2分的表現(xiàn)，且步態(tài)不穩(wěn)，或不能直線行走或步行時間向一側旋轉；6分：向單向斜臥，單側前肢和/或后肢癱瘓，行走困難、進食困難；8分：單側、前肢和/或后肢完全癱瘓，四肢拘攣，體重大幅度減輕，不能進食；10分：瀕臨死亡或死亡。2～6分大鼠為PD造模成功。

2.2 黑質區(qū)酪氨酸羥化酶（TH）免疫組化染色 以3.6%水合氯醛10 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，開胸經心臟以預冷生理鹽水常規(guī)灌注后立即斷頭取腦，分離中腦黑質組織，4℃下以4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，連續(xù)做冠狀切片，片厚5μm，冰凍切片用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗去聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物（optimal cutting temperature compound，OCT），檸檬酸鈉溶液煮沸抗原修復，抗體封閉液（1%牛血清白蛋白+0.3%Tritox-100）封閉30min，一抗用小鼠抗TH抗體（1∶10 000）4℃下孵育過夜；二抗分別用生物素化羊抗小鼠及兔抗羊（1∶400）抗體室溫孵育2 h；熒光標記卵白素（1∶400）室溫孵育40 min；hoechst染核10 min（1∶5 000）。以上步驟每步后均需PBS清洗3次，每次5 min，75%甘油封片。使用熒光顯微鏡在低倍鏡下計數(shù)TH免疫反應陽性神經細胞的個數(shù)。

2.3 氧化應激指標檢測 大鼠斷頭取腦后分離中腦組織，制備腦組織勻漿液：取腦組織塊0.3～0.5 g在冰生理鹽水溶液中漂洗，除去血液，濾紙拭干，放入小燒杯內；燒杯中加入冷的0.86%NaCl溶液0.65 ml，用眼科剪剪碎腦組織塊；剪碎的腦組織混懸液倒入勻漿管中，并加入冰的0.86%NaCl溶液0.3 ml進行勻漿，將勻漿液以4 000 r/min離心15 min；將上清液置-20℃冰箱中貯存，備用。氧化應激指標（GSH、GSH-Px、SOD、MDA）按試劑盒說明書步驟進行檢測。

2.4 統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計分析采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行。實驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，方差齊則組間比較采用單因素方差分析，方差不齊則先將其轉換為滿足方差齊性檢驗，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 加味五虎追風散對PD模型大鼠腦組織氧化應激水平的影響 見表1。

表1 加味五虎追風散對PD模型大鼠腦組織氧化應激反應的影響 （x±s）

表1結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠中腦黑質MDA含量顯著增加（P＜0.01），GSH含量、GSH-Px和SOD活性顯著減少（P＜0.01）；與模型組比較，加味五虎追風散組MDA含量顯著減少（P＜0.05），GSH含量、GSH-Px和SOD活性明顯增加（P＜0.05）。

3.2 各組大鼠中腦黑質多巴胺能神經元細胞數(shù)目的變化 見表2。

表2 各組大鼠中腦黑質部位TH免疫陽性神經元細胞數(shù)目比較 （個，x±s）

表2結果顯示，正常組大鼠中腦黑質致密區(qū)TH免疫陽性細胞表達較多，模型組大鼠中腦黑質致密區(qū)TH免疫陽性細胞表達較正常組明顯降低（P＜0.01）；經治療，加味五虎追風散組大鼠黑質致密區(qū)TH免疫陽性細胞數(shù)目顯著高于模型組（P＜0.01）。

4 討論

PD以肢體震顫、肌強直、隨意運動障礙為主要臨床表現(xiàn)，屬中醫(yī)學“顫癥”范疇，本病病位主要在腦，著于筋脈，關乎五臟，證屬本虛標實，腎虛為本病發(fā)病之根本，又涉及到肝、脾等臟腑；標實為“內風”“瘀血”“痰濁”而致經脈肢體失控，其中虛以肝腎陰虛為主；實以痰濁血瘀為要［7］。其中瘀既是病理產物，更是致病因素，而且在PD的不同階段均伴隨有不同程度的血瘀阻絡癥狀［8］。加味五虎追風散治療PD具有良好療效，方中壯藥大地棕根補腎活血、生髓榮腦，恰對病機，故為君藥；全蝎長于活血，僵蠶功在化痰，天麻善于息風，三者相配共起活血通絡、化痰息風之功，共為臣藥；蟬蛻祛風止痙，天南星解痙止顫，二者共為佐藥；諸藥相配，共奏補腎填精、化瘀通絡、祛痰息風之功。

魚藤酮是豆科藤本植物魚藤根部的一種活性成分，其作為廣譜殺蟲劑和魚毒已被長時間使用。大量流行病學及動物實驗表明魚藤酮有選擇性的多巴胺神經元毒性，可以使鼠科動物產生與PD相似的癥狀，還因其脂溶性強，能很好地穿透血腦屏障［9］，故可用于PD模型大鼠制作。且魚藤酮誘導PD大鼠的成模率較高，在病理、生化、致病機制、行為學等方面均能較好地模擬PD相關特征［10］，氧化應激損傷是魚藤酮導致大鼠腦內DA能神經元損害的主要機制［11］。魚藤酮可與線粒體復合物1結合并抑制其活性，阻斷細胞呼吸鏈的遞氫功能和氧化磷酸化過程，產生自由基和凋亡誘發(fā)因子，從而產生細胞毒作用。

PD是以黑質紋狀體DA能神經元缺失為主要特征的疾病，其發(fā)病與氧化應激、線粒體功能障礙及α-突觸核蛋白異常聚集有關［12］，其中氧化應激被認為是PD黑質神經元細胞死亡病理機制的主要因素［13］，在PD發(fā)病過程中，當體內氧自由基的產生與清除失平衡后可導致活性氧及氧自由基在體內堆積，清除自由基是減少黑質DA能神經細胞死亡的主要方式，而體內清除自由基的酶系統(tǒng)主要包括SOD、GSH-Px及過氧化氫酶等抗氧化酶［14］。GSH為一種低分子自由基清除劑，可清除H2O2、O2-，并維持細胞內環(huán)境穩(wěn)定，使暴露于氧化環(huán)境的組織免受自由基損害［15-16］，其含量的多少是衡量機體抗氧化能力的重要指標。GSH-Px是機體內廣泛存在的一種重要的催化H2O2分解的酶，可特異催化GSH對H2O2的還原反應，對細胞結構和功能的完整具有重要保護作用。而SOD與MDA是反映氧化應激的兩個指標，SOD通過歧化反映清除自由基，對氧化損傷起保護作用，其活力的高低反映了機體清除自由基的能力［17］，被看作是氧化應激的直接指示劑；MDA是受到氧自由基攻擊后形成的一種最終代謝產物，可間接反映組織受自由基攻擊的嚴重程度［18］。本實驗結果提示加味五虎追風散能夠明顯增加PD大鼠DA神經元GSH的含量，增加GSH-Px和SOD活性，降低丙二醛的含量，減少自由基的生成，增強機體清除自由基的能力，從而減輕氧化應激反應對機體的損害，以達到治療效果。

本實驗研究表明，魚藤酮誘導的PD模型大鼠中腦黑質MDA含量顯著增加，GSH含量、GSH-Px和SOD活性顯著減少，黑質TH免疫陽性神經元數(shù)目明顯減少，表明PD動物模型造模成功。經加味五虎追風散組干預后，PD模型大鼠腦組織中GSH-Px、SOD活性和GSH的含量明顯增加，MDA的含量明顯減少，黑質TH免疫陽性神經元數(shù)目明顯增加，表明加味五虎追風散對PD模型大鼠DA能神經元具有保護作用，其機制可能與加味五虎追風散減輕魚藤酮所致的氧化應激損傷有關。隨著對氧化應激介導的PD發(fā)病機制的深入研究，對PD抗氧化應激的治療必將得到更多的認識和發(fā)展，也為臨床治療和預防帕金森病提供新的實驗依據(jù)。