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        加味五虎追風(fēng)散對(duì)帕金森病模型大鼠多巴胺能神經(jīng)元氧化應(yīng)激水平的影響

        2020-05-29 03:08:42張興博梁健芬徐柳炎
        廣西中醫(yī)藥 2020年2期
        關(guān)鍵詞:五虎魚藤酮黑質(zhì)

        張興博,梁健芬,徐柳炎

        (廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530021)

        帕金森病(parkinson’s disease,PD)是以黑質(zhì)多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元缺失,胞內(nèi)出現(xiàn)路易小體(lewy bodies,LBs)為主要病理特征的老年常見運(yùn)動(dòng)障礙疾病。PD的發(fā)生與線粒體功能缺陷、氧化應(yīng)激、免疫異常、細(xì)胞凋亡等多種因素有關(guān)[1-4],其中氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)是導(dǎo)致DA能神經(jīng)元死亡的主要因素之一。迄今為止,PD的西醫(yī)治療仍以改善癥狀為主,不能阻止疾病進(jìn)展,其治療包括藥物、外科手術(shù)以及處于研究階段的神經(jīng)干細(xì)胞移植、基因治療等,但由于臨床上各種療法均存在不同程度的并發(fā)癥和副作用,嚴(yán)重影響了PD患者的生存質(zhì)量。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)加味五虎追風(fēng)散治療PD具有良好療效,可顯著改善患者的運(yùn)動(dòng)癥狀,而且與西藥合用還可降低西藥的副作用,從而提高患者生活質(zhì)量。本研究以魚藤酮葵花油乳化液誘導(dǎo)建立PD大鼠模型,觀察加味五虎追風(fēng)散對(duì)PD模型大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響,以探討其治療PD的作用機(jī)制,為化痰息風(fēng)療法治療PD提供科學(xué)依據(jù)。

        1 實(shí)驗(yàn)材料

        1.1 動(dòng)物 健康Wistar大鼠45只,雄性,體質(zhì)量200~230 g,由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK桂2009-0002。

        1.2 試藥與試劑 加味五虎追風(fēng)散:由蟬蛻6 g、天南星6 g、天麻12 g、全蝎3 g、僵蠶10 g、大地棕根15 g組成,以上中藥使用江蘇省江陰天江藥業(yè)有限公司的配方顆粒進(jìn)行調(diào)劑,制成湯藥濃度為0.38 g/ml,備用。魚藤酮(Rotenone),貨號(hào)R8875,購(gòu)自Sigma公司,使用時(shí)配制濃度為2 mg/ml,每天劑量為2 mg/kg。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒,貨號(hào):A005-1;谷胱甘肽(glutataione,GSH)試劑盒,貨號(hào):A006-1-1;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒,貨號(hào):A001-1;丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒,貨號(hào):A003-1-2;以上試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。免疫組化染色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,編號(hào):ZLI-9045;TH免疫組化試劑一抗、二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司,貨號(hào):A14419。

        2 實(shí)驗(yàn)方法

        2.1 動(dòng)物分組與給藥 45只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、加味五虎追風(fēng)散組,每組15只。模型組及加味五虎追風(fēng)散組按文獻(xiàn)[5]方法造模,均以2 mg/kg給藥劑量在大鼠頸背部皮下注射2 mg/ml的魚藤酮葵花油乳化液進(jìn)行造模,每日1次,連續(xù)給藥4周。正常組同法注射予相同體積的葵花油乳液,造模結(jié)束后給予藥物干預(yù),加味五虎追風(fēng)散組每日灌胃給予10 ml/kg加味五虎追風(fēng)散溶液,正常組、模型組每日給予等量的蒸餾水灌胃。參照CHEN等[6]行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),1分:大鼠出現(xiàn)拒捕行為減弱、豎毛、毛色變黃變臟、弓背、主動(dòng)活動(dòng)減少;2分:有1分的表現(xiàn),且主動(dòng)活動(dòng)減少明顯、動(dòng)作遲緩,并有震顫或步態(tài)不穩(wěn);4分:有2分的表現(xiàn),且步態(tài)不穩(wěn),或不能直線行走或步行時(shí)間向一側(cè)旋轉(zhuǎn);6分:向單向斜臥,單側(cè)前肢和/或后肢癱瘓,行走困難、進(jìn)食困難;8分:?jiǎn)蝹?cè)、前肢和/或后肢完全癱瘓,四肢拘攣,體重大幅度減輕,不能進(jìn)食;10分:瀕臨死亡或死亡。2~6分大鼠為PD造模成功。

        2.2 黑質(zhì)區(qū)酪氨酸羥化酶(TH)免疫組化染色 以3.6%水合氯醛10 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠,開胸經(jīng)心臟以預(yù)冷生理鹽水常規(guī)灌注后立即斷頭取腦,分離中腦黑質(zhì)組織,4℃下以4%多聚甲醛固定24 h,石蠟包埋,連續(xù)做冠狀切片,片厚5μm,冰凍切片用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗去聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物(optimal cutting temperature compound,OCT),檸檬酸鈉溶液煮沸抗原修復(fù),抗體封閉液(1%牛血清白蛋白+0.3%Tritox-100)封閉30min,一抗用小鼠抗TH抗體(1∶10 000)4℃下孵育過(guò)夜;二抗分別用生物素化羊抗小鼠及兔抗羊(1∶400)抗體室溫孵育2 h;熒光標(biāo)記卵白素(1∶400)室溫孵育40 min;hoechst染核10 min(1∶5 000)。以上步驟每步后均需PBS清洗3次,每次5 min,75%甘油封片。使用熒光顯微鏡在低倍鏡下計(jì)數(shù)TH免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞的個(gè)數(shù)。

        2.3 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 大鼠斷頭取腦后分離中腦組織,制備腦組織勻漿液:取腦組織塊0.3~0.5 g在冰生理鹽水溶液中漂洗,除去血液,濾紙拭干,放入小燒杯內(nèi);燒杯中加入冷的0.86%NaCl溶液0.65 ml,用眼科剪剪碎腦組織塊;剪碎的腦組織混懸液倒入勻漿管中,并加入冰的0.86%NaCl溶液0.3 ml進(jìn)行勻漿,將勻漿液以4 000 r/min離心15 min;將上清液置-20℃冰箱中貯存,備用。氧化應(yīng)激指標(biāo)(GSH、GSH-Px、SOD、MDA)按試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行檢測(cè)。

        2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,方差齊則組間比較采用單因素方差分析,方差不齊則先將其轉(zhuǎn)換為滿足方差齊性檢驗(yàn),P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        3 結(jié) 果

        3.1 加味五虎追風(fēng)散對(duì)PD模型大鼠腦組織氧化應(yīng)激水平的影響 見表1。

        表1 加味五虎追風(fēng)散對(duì)PD模型大鼠腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響 (x±s)

        表1結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組大鼠中腦黑質(zhì)MDA含量顯著增加(P<0.01),GSH含量、GSH-Px和SOD活性顯著減少(P<0.01);與模型組比較,加味五虎追風(fēng)散組MDA含量顯著減少(P<0.05),GSH含量、GSH-Px和SOD活性明顯增加(P<0.05)。

        3.2 各組大鼠中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目的變化 見表2。

        表2 各組大鼠中腦黑質(zhì)部位TH免疫陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目比較 (個(gè),x±s)

        表2結(jié)果顯示,正常組大鼠中腦黑質(zhì)致密區(qū)TH免疫陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)較多,模型組大鼠中腦黑質(zhì)致密區(qū)TH免疫陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)較正常組明顯降低(P<0.01);經(jīng)治療,加味五虎追風(fēng)散組大鼠黑質(zhì)致密區(qū)TH免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著高于模型組(P<0.01)。

        4 討論

        PD以肢體震顫、肌強(qiáng)直、隨意運(yùn)動(dòng)障礙為主要臨床表現(xiàn),屬中醫(yī)學(xué)“顫癥”范疇,本病病位主要在腦,著于筋脈,關(guān)乎五臟,證屬本虛標(biāo)實(shí),腎虛為本病發(fā)病之根本,又涉及到肝、脾等臟腑;標(biāo)實(shí)為“內(nèi)風(fēng)”“瘀血”“痰濁”而致經(jīng)脈肢體失控,其中虛以肝腎陰虛為主;實(shí)以痰濁血瘀為要[7]。其中瘀既是病理產(chǎn)物,更是致病因素,而且在PD的不同階段均伴隨有不同程度的血瘀阻絡(luò)癥狀[8]。加味五虎追風(fēng)散治療PD具有良好療效,方中壯藥大地棕根補(bǔ)腎活血、生髓榮腦,恰對(duì)病機(jī),故為君藥;全蝎長(zhǎng)于活血,僵蠶功在化痰,天麻善于息風(fēng),三者相配共起活血通絡(luò)、化痰息風(fēng)之功,共為臣藥;蟬蛻祛風(fēng)止痙,天南星解痙止顫,二者共為佐藥;諸藥相配,共奏補(bǔ)腎填精、化瘀通絡(luò)、祛痰息風(fēng)之功。

        魚藤酮是豆科藤本植物魚藤根部的一種活性成分,其作為廣譜殺蟲劑和魚毒已被長(zhǎng)時(shí)間使用。大量流行病學(xué)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明魚藤酮有選擇性的多巴胺神經(jīng)元毒性,可以使鼠科動(dòng)物產(chǎn)生與PD相似的癥狀,還因其脂溶性強(qiáng),能很好地穿透血腦屏障[9],故可用于PD模型大鼠制作。且魚藤酮誘導(dǎo)PD大鼠的成模率較高,在病理、生化、致病機(jī)制、行為學(xué)等方面均能較好地模擬PD相關(guān)特征[10],氧化應(yīng)激損傷是魚藤酮導(dǎo)致大鼠腦內(nèi)DA能神經(jīng)元損害的主要機(jī)制[11]。魚藤酮可與線粒體復(fù)合物1結(jié)合并抑制其活性,阻斷細(xì)胞呼吸鏈的遞氫功能和氧化磷酸化過(guò)程,產(chǎn)生自由基和凋亡誘發(fā)因子,從而產(chǎn)生細(xì)胞毒作用。

        PD是以黑質(zhì)紋狀體DA能神經(jīng)元缺失為主要特征的疾病,其發(fā)病與氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙及α-突觸核蛋白異常聚集有關(guān)[12],其中氧化應(yīng)激被認(rèn)為是PD黑質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞死亡病理機(jī)制的主要因素[13],在PD發(fā)病過(guò)程中,當(dāng)體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生與清除失平衡后可導(dǎo)致活性氧及氧自由基在體內(nèi)堆積,清除自由基是減少黑質(zhì)DA能神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要方式,而體內(nèi)清除自由基的酶系統(tǒng)主要包括SOD、GSH-Px及過(guò)氧化氫酶等抗氧化酶[14]。GSH為一種低分子自由基清除劑,可清除H2O2、O2-,并維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,使暴露于氧化環(huán)境的組織免受自由基損害[15-16],其含量的多少是衡量機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化H2O2分解的酶,可特異催化GSH對(duì)H2O2的還原反應(yīng),對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整具有重要保護(hù)作用。而SOD與MDA是反映氧化應(yīng)激的兩個(gè)指標(biāo),SOD通過(guò)歧化反映清除自由基,對(duì)氧化損傷起保護(hù)作用,其活力的高低反映了機(jī)體清除自由基的能力[17],被看作是氧化應(yīng)激的直接指示劑;MDA是受到氧自由基攻擊后形成的一種最終代謝產(chǎn)物,可間接反映組織受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示加味五虎追風(fēng)散能夠明顯增加PD大鼠DA神經(jīng)元GSH的含量,增加GSH-Px和SOD活性,降低丙二醛的含量,減少自由基的生成,增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力,從而減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)機(jī)體的損害,以達(dá)到治療效果。

        本實(shí)驗(yàn)研究表明,魚藤酮誘導(dǎo)的PD模型大鼠中腦黑質(zhì)MDA含量顯著增加,GSH含量、GSH-Px和SOD活性顯著減少,黑質(zhì)TH免疫陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少,表明PD動(dòng)物模型造模成功。經(jīng)加味五虎追風(fēng)散組干預(yù)后,PD模型大鼠腦組織中GSH-Px、SOD活性和GSH的含量明顯增加,MDA的含量明顯減少,黑質(zhì)TH免疫陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目明顯增加,表明加味五虎追風(fēng)散對(duì)PD模型大鼠DA能神經(jīng)元具有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與加味五虎追風(fēng)散減輕魚藤酮所致的氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。隨著對(duì)氧化應(yīng)激介導(dǎo)的PD發(fā)病機(jī)制的深入研究,對(duì)PD抗氧化應(yīng)激的治療必將得到更多的認(rèn)識(shí)和發(fā)展,也為臨床治療和預(yù)防帕金森病提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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