方秋野，王毛毛，劉瑤，王如福

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801)

薏苡(Coixlacryma-jobiL.)屬禾本科一年或多年生草本植物，其干燥成熟的種仁被稱為薏仁，又名薏米等[1]。薏仁在我國各地及亞洲其他國家均有分布，我國主產(chǎn)區(qū)為福建、貴州、江蘇、河北、遼寧等地[2]。其中，貴州省的薏仁資源較為豐富，是我國重要的薏仁生長區(qū)[3]。作為我國首批公布的藥食同源食品之一，薏仁的營養(yǎng)及藥用價值極高。著名醫(yī)藥典籍《本草綱目》就曾指出薏仁有“健脾益胃，補(bǔ)肺清熱，強(qiáng)筋健骨”之功效[4]。薏仁富含蛋白質(zhì)、氨基酸、淀粉、維生素、礦物質(zhì)、脂肪和水溶性纖維等營養(yǎng)成分，以及薏仁內(nèi)酯、黃酮和三萜類化合物和多糖等功能成分，臨床藥理研究表明，薏仁具有抗炎、抗腫瘤、降血糖、免疫調(diào)節(jié)及抑制骨質(zhì)疏松等多種藥理活性[5]。

國內(nèi)外對于薏仁的研究主要集中在薏仁多糖等功能成分的提取及提取工藝優(yōu)化等方面[6-9]。長期以來，薏仁的食用方法都以直接蒸煮為主，市面上缺少其深加工制品，加之其本身風(fēng)味不能被大眾完全接受，導(dǎo)致薏仁這一高營養(yǎng)價值谷物的流通和消費(fèi)受到了極大限制。如今隨著科技的飛速發(fā)展，對薏仁加工食品的研究與開發(fā)日益增加，魏建春等[10]以薏仁、紅棗為主料,優(yōu)化浸提制汁工藝,研制出了一款口感優(yōu)良、營養(yǎng)豐富的功能型保健飲料，呂峰等[11]通過均勻設(shè)計實(shí)驗優(yōu)選出最佳的薏仁酒釀造工藝條件等，但針對薏仁發(fā)酵前的液化及糖化工藝研究較少。薏仁中含有較多的活性功能成分，若在其發(fā)酵產(chǎn)品中能最大程度地保留這些物質(zhì)，將更有利于實(shí)現(xiàn)最終產(chǎn)品的功能化。而液化及糖化是薏仁發(fā)酵前的重要環(huán)節(jié)，同時也是功能成分較易損失的環(huán)節(jié)，在該階段的研究中應(yīng)保證薏仁糖化醪具有較好的發(fā)酵性能并且保留更多功能成分，這對薏仁發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)的提高具有重要的意義。

薏仁直鏈淀粉含量高，用其作為釀醋不易進(jìn)行糖化，并使得淀粉利用率低，用薏仁為單一原料進(jìn)行釀造使得產(chǎn)品口感寡淡，品質(zhì)不佳。高粱中含有較高淀粉、較低脂肪和適量的蛋白質(zhì)，是一種很好的釀醋原料[12]。同時，高粱所含支鏈淀粉含量較高，可促使薏仁較快地進(jìn)行液化及糖化反應(yīng)，并提高產(chǎn)酒率，而且酒液中殘留的低聚糖和極限糊精較多，口感醇厚[13]。故本試驗選擇添加一定量的高粱，在降低薏仁醋制品成本和提高產(chǎn)品品質(zhì)的同時，也改善了其風(fēng)味和口感，使其更易于被大眾接受。本試驗旨在確定薏仁液化及糖化的最優(yōu)工藝，為薏仁醋釀造中的液化及糖化工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

薏仁:產(chǎn)自貴州黔西南州；α-淀粉酶(40000 U/g)、糖化酶(100000 U/g)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)：北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 試驗設(shè)備

DS-1型組織搗碎機(jī) 上海昂尼儀器儀表有限公司；THZ-82恒溫振蕩水浴鍋 常州潤華電器有限公司；BS210S電子天平 德國賽多利斯集團(tuán)；722可見分光光度計 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；DZTW電子調(diào)溫電熱套 天津工興實(shí)驗室儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

薏仁→挑選→清洗→粉碎→糊化→加入耐高溫α-淀粉酶→加熱滅酶→加入糖化酶→加熱滅酶→薏仁糖化醪。

1.2.2 薏仁液化及糖化單因素試驗

以還原糖和總黃酮含量為指標(biāo)，在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上設(shè)置高粱添加量(0.6，0.7，0.8，0.9，1.0倍)、料水比例(1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6)、α-淀粉酶添加量(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)、液化溫度(70，75，80，85，90 ℃)、液化時間(20，30，40，50，60 min)、糖化酶添加量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)、糖化溫度(50，55，60，65，70 ℃)、糖化時間(20，30，40，50，60 min)8個單因素試驗，考察其對糖化終點(diǎn)還原糖及總黃酮含量的影響。

1.2.3 Plackett-Burman試驗設(shè)計

基于單因素試驗結(jié)果確定各因素的范圍，以薏仁糖化醪還原糖含量為響應(yīng)值，使用Design-Expert 10軟件創(chuàng)建Plackett-Burman試驗，對高粱添加量(A)、料水比例(B)、α-淀粉酶添加量(C)、液化溫度(D)、液化時間(E)、糖化酶添加量(F)、糖化溫度(G)、糖化時間(H)8 個變量進(jìn)行篩選，另設(shè)置3個虛擬變量來衡量試驗誤差，通過軟件分析篩選出對薏仁糖化醪有顯著影響的因素。

1.2.4 最陡爬坡試驗

基于Plackett-Burman試驗篩選出的顯著影響因素，以糖化醪還原糖含量為響應(yīng)值，設(shè)計爬坡方向并確定合適的步長，以求高效地逼近各因素的最佳取值范圍。

1.2.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

基于Plackett-Burman試驗和最陡爬坡試驗，依據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，選取液化溫度、液化時間、糖化酶添加量3個影響顯著的因素，以薏仁糖化醪還原糖含量和總黃酮含量為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平的試驗，見表1。

1.2.6 測定方法

總黃酮含量的測定：參考GB/T 19777-2013中的《總黃酮的檢測方法》。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)物，NaNO2-Al(NO3)3比色法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=0.4305x-0.0127，R2=0.9947，其中，y為吸光值，x為蘆丁質(zhì)量。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

式中：X為樣品中總黃酮(以蘆丁計)的含量，mg/100 g；m1為由工作曲線查出(或用回歸方程計算)試液中總黃酮(以蘆丁計)的質(zhì)量，mg；m為樣品的質(zhì)量，g。

還原糖的測定：參考GB/T 19777-2013附錄D《還原糖的檢測方法》。

1.2.7 感官評價

高粱添加量感官評分表見表2。

表2 高粱添加量感官評分表Table 2 The sensory scoring table of sorghum additive amount

2 結(jié)果與分析

2.1 薏仁液化及糖化單因素試驗

2.1.1 高粱添加量的確定

圖2 高粱添加量對薏仁糖化醪還原糖及總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of sorghum additive amount on the content of reducing sugar and total flavonoids in coax seed saccharificated mash

由圖2可知，糖化醪的還原糖和總黃酮含量隨著高粱添加量的增加而呈現(xiàn)平緩增長的趨勢。高粱經(jīng)液化及糖化后產(chǎn)生的醇厚香氣能克服純薏仁糖化醪香氣單薄的弱點(diǎn)，但過多的高粱則對混合糖化醪風(fēng)味產(chǎn)生壓制作用，使得糖化醪香氣單一，高粱氣味突出。

圖3 高粱添加量對薏仁糖化醪感官評分的影響Fig.3 Effect of sorghum additive amount on sensory score of coax seed saccharificated mash

由圖3可知，高粱添加量為0.8倍時，薏仁糖化醪有較好的感官評分。基于以上綜合考慮，選擇高粱添加量0.8倍為宜。

2.1.2 料水比的確定

圖4 料水比對薏仁糖化醪還原糖及總黃酮含量的影響Fig.4 Effect of material-water ratio on the content of reducing sugar and total flavonoids in coax seed saccharificated mash

由圖4可知，隨著水分添加比例的增大，糖化醪還原糖和總黃酮含量呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢，在料水比為1∶3時取最大值。水分過少，在實(shí)驗過程中發(fā)現(xiàn)糖化醪黏稠，液化困難，還原糖和總黃酮溶出較少，且在生產(chǎn)上也不利于料液的降溫和輸送[14]。而加水量過多則會導(dǎo)致糖化醪中還原糖和總黃酮濃度較低，不利于后續(xù)發(fā)酵。故選擇料水比為1∶3為宜。

2.1.3 耐高溫α-淀粉酶添加量的確定

圖5 淀粉酶添加量對薏仁糖化醪還原糖及總黃酮含量的影響Fig.5 Effect of α-amylase additive amount on the content of reducing sugar and total flavonoids in coax seed saccharificated mash

由圖5可知，隨著淀粉酶添加量的逐漸增多，薏仁糖化醪的還原糖和總黃酮含量迅速增加;但淀粉酶添加量大于0.3%時，還原糖和總黃酮含量基本趨于穩(wěn)定。這是因為淀粉酶添加量小于0.3%時，淀粉酶質(zhì)量濃度小于底物質(zhì)量濃度，糖化反應(yīng)速率受酶質(zhì)量影響較大，還原糖和總黃酮含量隨著酶量的增大而增加；酶添加量大于0.3%時，隨著酶的質(zhì)量濃度的增加，使得一部分的酶無法與底物接觸，從而導(dǎo)致糖化醪還原糖和總黃酮含量基本不再變化?？紤]成本因素，選擇淀粉酶添加量0.3%為宜。

2.1.4 液化溫度的確定

由圖6可知，淀粉酶對溫度較為敏感，耐高溫α-淀粉酶的最適反應(yīng)溫度為80～90 ℃，低于最適溫度酶的活力低，不利于其發(fā)揮作用，而溫度過高又會抑制酶活[15]，溫度的變化同時也影響著反應(yīng)速率；薏仁糖化醪還原糖含量受酶活力影響在85 ℃時達(dá)到最大值，總黃酮在液化溫度的變化過程中，受淀粉酶活力及氧化溫度的影響，在80 ℃達(dá)到最大值。故選取液化溫度80～85 ℃進(jìn)行下一步試驗為宜。

2.1.5 液化時間的確定

圖7 液化時間對薏仁糖化醪還原糖及總黃酮含量的影響Fig.7 Effect of liquefaction time on the content of reducing sugar and total flavonoids in coax seed saccharificated mash

由圖7可知，液化時間對薏仁糖化醪還原糖和總黃酮含量影響均較大，隨著液化時間的延長，還原糖和總黃酮呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢。液化前期底物淀粉濃度較高，此時α-淀粉酶與底物結(jié)合充分，使淀粉分子的α-1,4糖苷鍵斷裂，形成小分子的葡萄糖等物質(zhì)，還原糖含量迅速升高，黃酮類物質(zhì)也隨著液化時間的延長而析出。但較長時間的酶解使還原糖和黃酮結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定發(fā)生分解，故選擇液化時間40～50 min為宜。

2.1.6 糖化酶添加量的確定

圖8 糖化酶添加量對薏仁糖化醪還原糖及總黃酮含量的影響Fig.8 Effect of saccharifying enzyme additive amount on the content of reducing sugar and total flavonoids in coax seed saccharificated mash

由圖8可知，薏仁糖化醪的還原糖和總黃酮含量隨著糖化酶添加量的增多而增加，當(dāng)糖化酶添加量為2.0%時，還原糖含量達(dá)到11.8 g/mL，總黃酮含量為123.6 mg/100 g，達(dá)到了較高的飽和范圍，再繼續(xù)添加糖化酶量，還原糖和總黃酮含量雖有上升但變化并不明顯。從經(jīng)濟(jì)成本和糖化程度等因素進(jìn)行綜合考慮，選擇淀粉酶添加量2%為宜。

2.1.7 糖化溫度的確定

圖9 糖化溫度對薏仁糖化醪還原糖及總黃酮含量的影響Fig.9 Effect of saccharification temperature on the content of reducing sugar and total flavonoids in coax seed saccharificated mash

由圖9可知，糖化溫度對薏仁糖化醪還原糖及總黃酮含量的影響與液化溫度對其影響相似，故糖化溫度選擇60 ℃為宜。

2.1.8 糖化時間的確定

圖10 糖化時間對薏仁糖化醪還原糖及總黃酮含量的影響Fig.10 Effect of saccharification time on the content of reducing sugar and total flavonoids in coax seed saccharificated mash

由圖10可知，薏仁糖化醪還原糖和總黃酮含量隨著液化時間的延長呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢，其作用機(jī)理可能是糖化時間較短使糖化不完全，還原糖和總黃酮析出不充分，而較長時間的糖化過程使還原糖和黃酮結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定發(fā)生分解，且在40～50 min階段，糖化時間的延長對于薏仁糖化醪還原糖含量的增長貢獻(xiàn)不足以彌補(bǔ)對總黃酮的破壞程度，故綜合考慮選擇糖化時間40 min為宜。

2.2 Plackett-Burman試驗設(shè)計結(jié)果

以薏仁糖化醪還原糖含量為響應(yīng)值，進(jìn)行8因素12組試驗，每組平行測定3次，試驗結(jié)果見表3。

表3 Plackett-Burman試驗因素水平及影響Table 3 Factors and levels of Plackett- Burman experiment

續(xù) 表

注：“*”表示影響顯著(P<0.05)；“**”表示影響極顯著(P<0.01)。表6和表7同。

由表3可知，液化溫度(P=0.0027)、液化時間(P=0.0072)及糖化酶添加量(P=0.0067)對糖化醪還原糖含量影響極顯著；回歸方程為：還原糖含量=8.37+0.054A+0.0887B-4.167E-003C+0.43D+0.30E+0.31F+0.13G+0.10H，模型R2=0.9846，具有統(tǒng)計學(xué)意義，故Plackett-Burman試驗篩選的重要影響因素為液化溫度、液化時間和糖化酶添加量，對這3個因素進(jìn)行下一步的優(yōu)化，其余影響不顯著的因素則根據(jù)單因素優(yōu)化結(jié)果取值。

2.3 最陡爬坡試驗結(jié)果

基于Plackett-Burman試驗設(shè)計結(jié)果，選取液化溫度、液化時間和糖化酶添加量3個因素進(jìn)行最陡爬坡試驗，試驗結(jié)果見表4。

表4 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 The steepest ascent experimental design and results

由表4可知，第4組試驗得到的還原糖含量最高，故3個因素的中心點(diǎn)分別取為：液化溫度85 ℃，液化時間50 min，糖化酶添加量2.0%。

2.4 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.4.1 Box-Behnken試驗設(shè)計方案及結(jié)果

以薏仁糖化醪還原糖含量和總黃酮含量為響應(yīng)值，采用Design-Expert 10軟件提供的Box-Behnken試驗和響應(yīng)面分析[16]，對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，試驗結(jié)果見表5。

表5 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Box-Behnken experimental design and results

續(xù) 表

2.4.2 模型的建立與方差分析

運(yùn)用Design-Expert 10數(shù)據(jù)處理軟件對表5中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，經(jīng)二次多元回歸擬合，結(jié)果見表6和表7。

表6 還原糖含量的方差分析Table 6 Analysis of variance of reducing sugar

表7 總黃酮含量的方差分析Table 7 Analysis of variance of total flavonoids

方差分析結(jié)果顯示：2 個模型的P值均小于0.0001，且失擬項P 值均大于0.05，故2個模型均為回歸顯著型。R12(還原糖含量)=0.9925，R22(總黃酮含量)=0.9932，表明預(yù)測值與實(shí)驗值之間擬合度較高。各因素對薏仁糖化醪還原糖含量的影響大小為：液化溫度(A)>液化時間(B)>糖化酶添加量(C)，各因素對薏仁糖化醪總黃酮含量的影響大小為：糖化酶添加量(C)>液化溫度(A)>液化時間(B)。經(jīng)過回歸擬合，分別得到Y(jié)1(還原糖含量)和Y2(總黃酮含量)的二次元回歸方程：

Y1=13.26-1.26A-1.18B+0.47C+1.04AB-1.10AC+1.21BC-1.41A2-0.39B2-1.80C2，Y2=132.87-7.39A+0.077B-7.91C+5.63AB-2.44AC-0.75BC-4.53A2-19.96B2-2.29C2。

2.4.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析

運(yùn)用Design-Expert 10軟件對表5中數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，繪制出3個因素之間的交互作用對薏仁糖化醪還原糖及總黃酮含量的影響，見圖11。

圖11 各因素交互作用對薏仁糖化醪還原糖和 總黃酮含量影響的響應(yīng)面圖

由圖11中a～c可知，液化溫度、液化時間和糖化酶添加量兩兩交互項均對薏仁糖化醪的還原糖含量產(chǎn)生了顯著的影響。由圖11中 a和b可知，當(dāng)液化時間和糖化酶添加量一定時，隨著液化溫度的升高，糖化醪還原糖含量先增大，達(dá)到極大值后開始下降。這是因為液化溫度過高，導(dǎo)致還原糖受熱不穩(wěn)定發(fā)生分解，而溫度過低，則使液化不充分，從而還原糖析出不充分。由圖11中a和c可知，當(dāng)液化溫度和糖化酶添加量一定時，隨著液化時間的延長，糖化醪的還原糖含量先增大后減少。這是因為液化時間過短使得液化不充分，時間過長則破壞還原糖的穩(wěn)定性使其分解從而減少。由圖11中b和c可知，當(dāng)液化溫度和液化時間一定時，隨著糖化酶添加量的增加，還原糖含量同樣呈現(xiàn)出先增大后減少的變化。

由圖11中d～f可知，液化溫度與液化時間的交互作用、液化溫度與糖化酶添加量的交互作用均對薏仁糖化醪總黃酮含量影響顯著，液化時間與糖化酶添加量的交互作用對總黃酮含量影響不顯著。這與方差分析結(jié)果一致。

由回歸方程擬合得到的薏仁糖化液化及糖化的最優(yōu)工藝條件為：液化溫度81.57 ℃，液化時間47.65 min，糖化酶添加量1.8915%。在此優(yōu)化條件下薏仁糖化醪的還原糖理論值為13.595 g/dL，總黃酮含量理論值為136.795 mg/100 g。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)，將以上最優(yōu)工藝條件調(diào)整為：液化溫度81.5 ℃，液化時間47 min，糖化酶添加量1.9%。在此條件下重復(fù)3次試驗進(jìn)行驗證，得到的糖化醪還原糖含量為13.2 g/dL，與預(yù)測值相比誤差為2.9%；總黃酮含量為136.55 mg/100 g，與預(yù)測值相比誤差為0.17%，由此可知，利用該模型優(yōu)化所得的條件準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

本研究設(shè)置了高粱添加量、料水比、α-淀粉酶添加量、液化溫度、液化時間、糖化酶添加量、糖化溫度、糖化時間8個單因素試驗，考察其對糖化醪還原糖及總黃酮含量的影響。在單因素的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman試驗，快速有效地篩選出顯著影響薏仁糖化醪還原糖和總黃酮含量的3個主要因素分別為液化溫度、液化時間和糖化酶添加量。通過Box-Behnken試驗設(shè)計和響應(yīng)面分析確定了薏仁糖化最優(yōu)工藝條件為：高粱添加量0.8倍，料水比1∶3，α-淀粉酶添加量0.3%，液化溫度81.5 ℃，液化時間47 min，糖化酶添加量1.9%，糖化溫度60 ℃，糖化時間40 min。在此條件下得到的薏仁糖化醪還原糖含量可達(dá)13.2 g/dL，總黃酮含量可達(dá)136.55 mg/100 g。