彭 曦 熊 維 黃海艷 鄒彥芬 姜 彬 劉小明 簡杏玲 于 波

北京大學深圳醫(yī)院皮膚科，深圳，518000

病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，在白種人群中增生性瘢痕的發(fā)病率在5%～37%，在黑色人種中的發(fā)生率是白種人的5～15倍，而膚色較淺的亞洲人種發(fā)病率介于兩者之間[1]。其中，增生性瘢痕在臨床上表現(xiàn)為不超過傷口范圍的高出皮表面的瘢痕組織，好發(fā)于女性，早期充血明顯，伴瘙癢或疼痛等感覺，位于關節(jié)部位則可能會引起活動功能障礙，具有浸潤生長，易復發(fā)等一些類似腫瘤的特性，因此近年來被列為良性腫瘤的范圍[2]。目前瘢痕的發(fā)病機制不明確、治療手段多樣但效果均很有限，是皮膚科及整形科的難題之一[3]。目前常用的激光設備，如PDL的靶色基為血紅蛋白，選擇性加熱血紅蛋白，破壞血管內皮細胞，起到封閉血管的作用，CO2FL的靶色基為皮膚組織中的水分，加熱后刺激膠原纖維的增生與重塑。這兩種激光被多個臨床研究證實對增生性瘢痕的預防及治療均有效，有臨床研究[4，5]應用兩者聯(lián)合治療，證實有效，也有相應的動物實驗研究兩者聯(lián)合治療的效果及探討其機制[6]。本研究擬在兔耳動物模型上，比較兩種激光設備對增生性瘢痕的預防及治療作用，以明確聯(lián)合治療效果是否優(yōu)于單種激光治療，以及早期干預對于增生性瘢痕的預防及治療是否重要。

1 材料與方法

1.1 兔耳瘢痕造模與分組 參考Morris等[7]報道的方法，構建兔耳增生性瘢痕模型，簡單敘述如下：選取20只雌性新西蘭大耳白兔，體重在2.5 kg左右，采用3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈麻醉后，在兔雙耳腹側各做8處直徑為1 cm的全層皮膚及軟骨膜缺損切口，切口之間間距1 cm以上，每只兔耳選取造模成功6處切口進行后續(xù)實驗，共計選取240個切口。術后待創(chuàng)面自然愈合，正常飼養(yǎng)。待術后2周，所有創(chuàng)面愈合(即上皮化)后，隨機選取10只入上皮化實驗；剩余10只待術后4周瘢痕形成，入瘢痕實驗。上皮化實驗分為CON-1(對照組-1)、PDL-1組、CO2FL -1組和PDL+CO2FL-1(聯(lián)合組-1)；瘢痕實驗分為CON-2(對照組-2)、PDL-2組、CO2FL-2組和PDL+CO2FL-2(聯(lián)合組-2)。見圖1、2。

1.2 治療方案與取材 在上皮實驗和瘢痕實驗中：CON組不做任何治療干預；PDL組接受PDL激光(585 nm)治療，共2次，間隔2周，參數(shù)為能量5.5～8.5 J/cm2、脈寬0.5～2 ms、頻率1 Hz、光斑7 mm；CO2FL組接受CO2FL激光(10 600 nm)治療，共2次，間隔2周，參數(shù)為微脈沖60 mJ、密度5%、重復2～6次、光斑可調；聯(lián)合組在單次治療中先予以PDL治療，后即刻予以CO2FL治療(共2次，間隔2周，PDL和CO2FL的參數(shù)設置同上。考慮到兔耳不同部位的瘢痕有可能會對治療效果造成影響(例如兔耳邊緣及中央)，因此治療過程中每側兔耳隨機選擇不同的部位進行不同的激光治療。

關于取材方案，在上皮化實驗中，在上皮化后干預治療前(0天)和上皮化后2周(14天)、4周(28天)分別切取4組的增生性瘢痕，共計取材120處，用于組織學、RNA分析。瘢痕實驗取材方案與上皮化實驗相同。

1.3 觀察指標 具體觀察指標包括：①瘢痕增生指數(shù)(scar elevation index，SEI)：即SEI=(瘢痕厚度-正常兔耳厚度)/正常兔耳厚度；當SEI>1.6，認為存在明顯瘢痕，提示瘢痕增生模型成功。②瘢痕內成纖維細胞密度：采用HE染色法對瘢痕進行細胞學分析，按照HE染色試劑盒(武漢谷歌生物科技公司，G1005)步驟操作。在普通光學顯微鏡下觀察瘢痕塊的組織結構和成纖維分布，計算成纖維細胞密度，具體方法如下：在瘢痕切片的中央和四周共選取5個視野，采用Image Pro Plus 6.0軟件計算出視野內成纖維細胞數(shù)目，求出與視野面積的比值，并算出5個視野的平均成纖維細胞密度值。③膠原纖維面積百分比：采用Masson染色法對瘢痕進行膠原纖維形成情況分析，按照Masson染色試劑盒(Servicebio，G1006)步驟操作。在普通光學顯微鏡下觀察瘢痕塊的膠原纖維形成和分布，計算膠原纖維面積百分比，具體方法如下：在瘢痕切片的中央和四周共選取5個視野，采用Image Pro Plus 6.0軟件計算出視野內藍染的膠原纖維面積，求出該面積與組織總面積的比值，即膠原纖維面積百分比，并算出5個視野的平均膠原纖維面積百分比。④細胞凋亡率：采用TUNEL法評估瘢痕組織內細胞凋亡情況，按照TUNEL染色試劑盒(羅氏，11684817910)步驟操作。凋亡細胞的細胞核呈現(xiàn)淡棕色至深棕黃色顆粒。高倍鏡下，每張切片隨機選取3個陽性細胞最多的視野進行計數(shù)，計算凋亡細胞率(凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù))，取3個視野的均數(shù)。⑤TGF-β1、Smad3基因的mRNA表達水平：提取瘢痕組織內的總RNA，采用RT-PCR方法，進行40個循環(huán)擴增， GAPDH為內參基因，采用靶基因量=2-δδCt公式計算TGF-β1、Smad3基因mRNA水平，采用比較Ct值方法以內參相對定量靶基因表達水平。引物設計如下：TGF-β1:(F)5’-TGGAACGGGCTCAACATCTACAC-3’，(R)5’-AATGTACAGCTGCCGCACAC-3’；Smad3:(F)5’-CAGCGACCACCAGATGAAC-3’,(R)5’-AGGAGATGGAGCACCAGAAT-3’；GAPDH:(F)5’-ACCACAGTCCATGCCTACAC-3’,(R)5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 12.0軟件進行統(tǒng)計學分析，P<0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 兔耳瘢痕增生指數(shù)變化情況 在上皮化實驗部分，與對照組相比，聯(lián)合組術后14天(P<0.01)和28天(P<0.01)的SEI均顯著下降，此外分別與PDL組和CO2FL組相比，聯(lián)合組的SEI均較相同時間點顯著下降(P<0.05)。結果提示聯(lián)合組較單獨處理治療更能有效預防上皮化后創(chuàng)面瘢痕增生。見表1、圖1。在瘢痕實驗部分，與對照組相比，聯(lián)合組術后14天(P<0.01)和28天(P<0.01)的SEI均顯著下降；分別與PDL組和CO2FL組相比，聯(lián)合組的SEI均較相同時間點顯著下降(P<0.05)。結果提示聯(lián)合PDL與CO2FL治療較單獨處理更能有效改善增生性瘢痕。見表1、圖2。

表1 兔耳瘢痕增生指數(shù)變化情況

注：與聯(lián)合組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2 瘢痕內成纖維細胞密度及膠原纖維面積變化情況 鑒于治療效果在28天可見顯著差異，我們進一步關注治療28天和治療前的效果比較。在上皮化實驗部分，與對照組相比，聯(lián)合組術后28天瘢痕內成纖維細胞密度(P<0.05)和膠原纖維面積百分比(P<0.01)均顯著下降，此外和CO2FL組相比，聯(lián)合組術后28天瘢痕內成纖維密度(P<0.05)和膠原纖維面積百分比(P<0.05)均顯著下降；而與PDL組相比未見明顯差異。結果提示聯(lián)合組較CO2FL處理治療更能有效預防上皮化后創(chuàng)面瘢痕增生。在瘢痕實驗部分，與對照組相比，聯(lián)合組術后28天瘢痕內成纖維細胞密度(P<0.05)和膠原纖維面積百分比(P<0.05)均顯著下降；與CO2FL組相比，聯(lián)合組術后28天瘢痕內成纖維細胞密度(P<0.05)和膠原纖維面積百分比(P<0.05)均顯著下降；而與PDL組相比未見明顯差異。結果提示聯(lián)合PDL與CO2FL治療較CO2FL處理更能有效改善增生性瘢痕。見表2。

2.3 瘢痕內細胞凋亡檢測結果 在上皮化實驗部分，與對照組相比，聯(lián)合組術后28天瘢痕內細胞凋亡率(P<0.01)顯著上升，此外與CO2FL組或PDL組相比，聯(lián)合組術后28天瘢痕內細胞凋亡率(P<0.05)顯著上升；提示聯(lián)合組較單獨處理治療更能有效促進上皮化后創(chuàng)面瘢痕內細胞凋亡。瘢痕實驗的結果趨勢與上皮化實驗趨勢相一致，結果提示聯(lián)合PDL與CO2FL治療較單獨處理更能有效促進增生性瘢痕內細胞凋亡。見圖3。

2.4 TGF-β1、Smad3的mRNA表達情況 在上皮化實驗部分，與對照組相比，聯(lián)合組術后28天瘢痕內TGF-β1和Smad3 mRNA水平(P<0.01)顯著下降，此外和CO2FL組或PDL組相比，TGF-β1和Smad3 mRNA均未見明顯差異；在瘢痕實驗部分，與對照組相比，聯(lián)合組術后28天瘢痕內TGF-β1 和Smad3 mRNA水平顯著下降(P<0.01)，與CO2FL組相比，TGF-β1和Smad3 mRNA水平下降(P<0.05)，而與PDL組相比，TGF-β1和Smad3 mRNA水平未見明顯差異。結果提示聯(lián)合組治療更有效抑制上皮化后及增生性瘢痕內TGF-β1和Smad3 mRNA水平上升。見圖4、5。

圖1 上皮化后創(chuàng)面瘢痕增生治療情況 1a、1b：上皮化創(chuàng)面;1c、1d:接受治療第14、28天 注：C為CO2FL，P為PDL，P+C為聯(lián)合組，(-)為對照組 圖2 增生性瘢痕治療情況 2a、2b：增生性瘢痕;2c、2d：接受治療第14、28天 注：C為CO2FL，P為PDL，P+C為聯(lián)合組，(-)為對照組

表2 兔耳瘢痕內成纖維細胞密度指標和膠原纖維面積百分比變化情況

注：*P<0.05，**P<0.01

*P<0.05，**P<0.01

*P<0.05，**P<0.01

*P<0.05，**P<0.01

3 討論

增生性瘢痕的發(fā)病機制尚不完全清楚，治療效果有限，是研究的熱點與難點之一。其治療方法多種多樣，主要有：藥物治療、壓迫治療、放射治療、硅膠薄膜、生物治療、激光治療、基因治療等[4-8]。隨著激光技術的發(fā)展，多種激光設備被用于治療增生性瘢痕。目前已有動物實驗及臨床研究證實激光對增生性瘢痕有治療作用[9-11]。根據(jù)治療時期的不同可將其分成：前期以抑制瘢痕的血管增生為主；后期以抑制瘢痕的成纖維細胞增生，促進細胞凋亡為主；成熟期以削平凸起的瘢痕組織，促進膠原再生與表皮重建為主。由于激光設備和波長的不同,其作用機制可能不是單方面的,而是多種機制共同作用來治療瘢痕。針對血管治療的激光有：脈沖染料激光(PDL)585 nm、595 nm，Versa Pulse可調脈寬倍頻Nd:YAG532 nm，強脈沖光(IPL)等[12-14]。刺激膠原再生與組織重塑的代表性激光有2940 nm Er:YAG點陣激光、點陣CO2激光等[15]。

針對兔耳增生性瘢痕模型的研究：Kuo等[16]研究證實脈沖染料激光(PDL)可減少 TGF-β的表達，從而抑制成纖維細胞的增殖與分裂，減少膠原沉積。朱玉等[17]驗證不同治療周期PDL照射均可抑制兔耳增生性瘢痕成纖維細胞的增殖過程，誘導細胞凋亡，且1周治療組與2周治療組兩組無明顯差異。王家亮等[18]發(fā)現(xiàn)2940 nm點陣鉺激光能有效改善兔耳增生性瘢痕的厚度，降低瘢痕組織中VEGF的表達，從而達到治療目的，猜測2940 nm點陣鉺激光治療機制與改善瘢痕內血管與膠原的增生有關。譚軍等[19]證實點陣CO2激光治療兔耳增生性瘢痕使瘢痕軟化、完全平坦所需時間縮短、成纖維細胞數(shù)量明顯減少、膠原排列有序，成纖維細胞凋亡較對照組明顯增高，同時降低VEGF的表達，促進瘢痕的成熟與萎縮，達到治療的目的。李軍[6]通過比較治療前后瘢痕增生指數(shù),免疫組織化學SP法檢測瘢痕組織中膠原蛋白I、III的水平，證實CO2點陣激光和595 nm脈沖染料激光聯(lián)合治療，有利于兔耳增生性瘢痕的治療,其機制與抑制膠原蛋白合成和改善膠原結構有關。

本研究通過對兔耳瘢痕進行激光治療后，進行病理切片HE染色觀察瘢痕增生指數(shù)及瘢痕內成纖維細胞密度，Masson染色觀察膠原纖維面積百分比，TUNEL法檢測瘢痕內細胞凋亡率，RT-PCR檢測TGF-β1、Smad3的mRNA表達，明確了PDL和CO2FL對增生性瘢痕的預防及治療均有效，且兩者聯(lián)合運用效果更好。在上皮化實驗及瘢痕實驗中，聯(lián)合治療組與未治療的對照組相比，均顯示有效；聯(lián)合治療組與PDL組、CO2FL組對比，多數(shù)顯示更有效。但在上皮化實驗及瘢痕實驗中，聯(lián)合組與PDL組的瘢痕內成纖維細胞密度及膠原纖維面積百分比，相比無顯著差異；聯(lián)合組與PDL組的TGF-β1、Smad3的表達無顯著差異。上皮化實驗的TGF-β1、Smad3的表達與CO2FL組無顯著差異。說明聯(lián)合治療有效，單一的PDL或CO2FL也有效果，但相對而言，聯(lián)合治療效果更佳。通過實驗發(fā)現(xiàn)，激光治療后TGF-β1和Smad3 mRNA水平下降，成纖維細胞凋亡增多，瘢痕內成纖維細胞及膠原纖維減少，因此可以推測激光治療通過下調TGF-β1-Smad3途徑促使成纖維細胞凋亡而抑制血管內皮細胞的增生，使膠原纖維的代謝恢復正常，促使瘢痕萎縮變平，從而達到治療效果。但實驗由于數(shù)據(jù)過多，未將上皮實驗與瘢痕實驗的數(shù)據(jù)做對比，因此很難得出提前干預瘢痕是否會有更好效果的結論。