閆楚凡，王靜，2，張勁松，2

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科，遼寧省晶狀體學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110005；2.沈陽愛爾卓越眼科醫(yī)院白內(nèi)障中心，沈陽 110001）

晶狀體是位于玻璃體前的透明無血管組織，光線經(jīng)其折射后在視網(wǎng)膜上形成清晰圖像，因此晶狀體透明度的維持對視力十分重要。晶狀體包含晶狀體上皮細(xì)胞和由其分化而來的纖維細(xì)胞2種細(xì)胞。在晶狀體的赤道部上皮細(xì)胞中的細(xì)胞器逐漸退化，分化成纖維細(xì)胞并將其向晶狀體核壓縮，這個過程稱為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）。隨著年齡的增長，晶狀體的體積和質(zhì)量都在不斷增大［1］，由于氧化應(yīng)激、紫外線照射等原因?qū)е翬MT過程發(fā)生障礙，可以導(dǎo)致晶狀體渾濁并形成白內(nèi)障，嚴(yán)重影響視力。

自噬是細(xì)胞內(nèi)重要的分解代謝過程，是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白大分子和細(xì)胞器（線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等）被雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬泡包裹并運(yùn)送到溶酶體進(jìn)行溶解消化的過程［2］。自噬通常分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。其中巨自噬研究最廣泛，本研究自噬為巨自噬。自噬可以影響多種生物學(xué)過程（增殖、凋亡等），GUGNONI等［3］認(rèn)為自噬與EMT之間存在著復(fù)雜的相互作用關(guān)系，二者水平的提高可以幫助腫瘤細(xì)胞在極端條件下存活，而在這個過程中，細(xì)胞骨架和線粒體作為調(diào)控的功能中心起到了重要作用。但二者之間具體的相互作用機(jī)制目前尚不清楚。

目前已經(jīng)報道30多種自噬相關(guān)基因，其中自噬相關(guān)基因4A（autophagy-related gene 4A，ATG4A）是一種半胱氨酸蛋白酶，可以在C-末端切割A(yù)TG8，暴露出的甘氨酸能夠與磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）結(jié)合形成ATG8-PE系統(tǒng)，該系統(tǒng)在自噬泡的形成過程中起到了重要的作用［4-5］，但是該基因在EMT方面的作用尚不清楚。本研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，探索ATG4A在晶狀體上皮細(xì)胞EMT中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、試劑和儀器

人晶狀體上皮細(xì)胞HLE B3細(xì)胞株，購自美國ATCC公司，經(jīng)細(xì)胞系短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）鑒定。ATG4A慢病毒質(zhì)粒購于加拿大ABM公司。試劑和儀器包括DMSO（美國SIGMA公司），MEM培養(yǎng)液、雙抗、胰蛋白酶、PBS（中國凱基公司），胎牛血清（FBS，澳洲AusGeneX公司），RNA iso Plus，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），Trixon X-100（中國Solarbio公司），4%多聚甲醛（中國博士德公司），SDS-PAGE膠（中國碧云天公司），PCR逆轉(zhuǎn)錄儀（美國BIO-RAD公司），mRNA引物（中國 Genecreate 公司），RT-PCR儀（美國Applied Biosystem公司），熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將HLE B3 細(xì)胞凍存管從-80 ℃冰箱中取出，迅速放入37 ℃水浴鍋中搖晃至融化，將其放入離心機(jī)中1 000 r/min離心3 min，棄掉上清并加入1 mL完全培養(yǎng)基，吹打至單細(xì)胞懸液后移至中皿（直徑=6 cm）中，另加入4 mL完全培養(yǎng)基并吹打均勻。棄去舊培養(yǎng)基，PBS沖洗2次并加入新完全培養(yǎng)基（中皿）繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長至密度為80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶液消化，收集細(xì)胞后加入新鮮完全培養(yǎng)基鋪皿并吹打均勻，按1 ∶3比例傳代培養(yǎng)。細(xì)胞凍存液（完全培養(yǎng)基∶FBS ∶DMSO=7 ∶2 ∶1）凍存細(xì)胞。正常完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞為對照組，H2O2濃度200 μmol/L培養(yǎng)細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組。

1.2.2 ATG4A慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：引物序列包括CMV，5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'；SV40，5'-TAGTCAGCCATGGGGCGGAGA-3'，將細(xì)胞傳代至6孔板中，取對數(shù)生長期HLE B3細(xì)胞待其密度至50%時換無血清無雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，棄掉培養(yǎng)基，加入在室溫下靜置了20 min的轉(zhuǎn)染混合液（4 μg質(zhì)粒DNA，10 μL LipoGeneTM2000 Star 轉(zhuǎn)染液和0.5 mL Opti-MEM），另加入2 mL Opti-MEM并在培養(yǎng)箱中培育6 h，棄轉(zhuǎn)染混合液并換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染ATG4A質(zhì)粒的人晶狀體上皮細(xì)胞為過表達(dá)ATG4A組（OE-ATG4A組），轉(zhuǎn)染空載體的人晶狀體上皮細(xì)胞為陰性對照組（NC組）。

1.2.3 實(shí)時qPCR檢測各組細(xì)胞中EMT：分別提取經(jīng)H2O2處理24 h后正常培養(yǎng)的細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染36 h后的細(xì)胞的總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將得到的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用實(shí)時PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時qPCR反應(yīng)，操作步驟遵循說明書。所用引物序列如下：ATG4A，上游引物5'-AATGGCACAAATGGGTGTAGG-3'，下游引物5'-CCAAGGAATTCCATTCGTCAA-3'；VIM，上游引物5'-AGAGAGGAAGCCGAAAACACC-3'，下游引物5'-GATTCCACTTTGCGTTCAAGG-3'；E-cadherin，上游引物5'-TGCTGTTTCTTCGGAGGAGAG-3'，下游引物5'-GCAGCTGGCTCAAGTCAAAGT-3'。

1.2.4 Western blotting檢測各組細(xì)胞中EMT：細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，利用蛋白快速提取試劑盒提取總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度。利用SDS-PAGE膠分離蛋白，并通過濕轉(zhuǎn)膜方式將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，用ATG4A（1 ∶1 000），VIM（1 ∶2 000），E-cadherin（1 ∶5 000）4 ℃搖床上過夜孵育，GAPDH（1 ∶10 000）作為內(nèi)參對照，將孵育過一抗的PVDF膜用山羊抗兔二抗（1 ∶2 000）室溫下?lián)u床上孵育2 h，使用化學(xué)發(fā)光檢測液進(jìn)行顯影。

1.2.5 DCFH-DA活性氧熒光探針檢測各組HLE B3細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平：HLE B3細(xì)胞提前傳代至6孔板中，并轉(zhuǎn)染ATG4A質(zhì)粒和空載體。胰蛋白酶消化細(xì)胞至15 mL離心管中，用10 μmol/L DCFH-DA標(biāo)記細(xì)胞于37 ℃中20 min，每隔3～5 min顛倒混勻。用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次后，用流式細(xì)胞儀分析2組細(xì)胞中ROS水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，本研究中測量指標(biāo)的計量資料經(jīng)K-S檢驗(yàn)呈正態(tài)分布，以表示；2組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H2O2模型中晶狀體上皮細(xì)胞的EMT水平

使用實(shí)時qPCR和Western blotting方法分別從mRNA和蛋白水平檢測H2O2對EMT水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，在mRNA水平波形蛋白（vimentin，VIM）表達(dá)量上升，E-鈣黏蛋白表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），說明EMT水平明顯加強(qiáng)。但蛋白水平表達(dá)均無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。見表1、圖1。

2.2 過表達(dá)ATG4A的晶狀體上皮細(xì)胞中EMT水平

表1 H2O2與ATG4A對HLE B3細(xì)胞EMT水平的影響Tab.1 Effects of H2O2 and ATG4A on EMT in HLE B3 cells

圖1 Western blotting檢測H2O2與ATG4A對HLE B3細(xì)胞EMT水平的影響Fig.1 Western blotting analysis for evaluating the effects of H2O2 and ATG4A on EMT in HLE B3 cells

結(jié)果顯示，在mRNA和蛋白水平，與NC組比較，OE-ATG4A組中VIM的表達(dá)量均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），而E-鈣黏蛋白表達(dá)水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），見表1、圖1。說明ATG4A能夠促進(jìn)EMT。

2.3 ATG4A過表達(dá)對晶狀體上皮細(xì)胞中ROS水平的影響

結(jié)果顯示，與NC組（230.930±6.746）比較，OEATG4A組（233.190±7.099）晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度并沒有顯著增強(qiáng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。本實(shí)驗(yàn)中沒有發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ATG4A能夠促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞中ROS的水平，該表型還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖2 ATG4A對HLE B3細(xì)胞中ROS水平的影響Fig.2 The effect of ATG4A on ROS level in HLE B3 cells

3 討論

白內(nèi)障是世界范圍內(nèi)致盲的首要原因［6］，它的形成受多種條件因素（紫外線、氧化應(yīng)激、激素不良反應(yīng)等）影響。這些影響因素通過促進(jìn)或者抑制相關(guān)基因表達(dá)，使晶狀體上皮細(xì)胞增殖、凋亡、EMT異常，進(jìn)而導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生。用H2O2處理晶狀體上皮細(xì)胞，構(gòu)建的年齡相關(guān)性白內(nèi)障模型被廣泛應(yīng)用于晶狀體的發(fā)生發(fā)展與白內(nèi)障形成的研究中［7］。

晶狀體中有多種酶存在，具有緩解或阻止蛋白質(zhì)等大分子異常聚集，維持晶狀體透明性作用［8］，而ATG4A是自噬基因中唯一的蛋白酶［9］。本研究結(jié)果顯示，在mRNA和蛋白水平均發(fā)現(xiàn)H2O2處理的人晶狀體上皮細(xì)胞中ATG4A表達(dá)量顯著升高，說明ATG4A能夠影響晶狀體上皮細(xì)胞的發(fā)育。

目前關(guān)于ATG4A的研究主要集中于其對腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響。YANG等［10］研究表明ATG4A在胃腸道腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，能夠促進(jìn)胃腸道腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移以及代謝。WOLF等［11］發(fā)現(xiàn)ATG4A能夠維持乳腺癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性。ATG4A在肺癌［12］、子宮頸癌［13］中的作用也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，但在晶狀體發(fā)生發(fā)展與白內(nèi)障形成中的作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，在過表達(dá)ATG4A的人晶狀體上皮細(xì)胞中，EMT水平明顯升高，證明ATG4A對該表型有促進(jìn)作用。

自噬與EMT的關(guān)系在眼科疾病中的研究較少，目前只集中于視網(wǎng)膜疾病，且多是細(xì)胞層面的實(shí)驗(yàn)。FENG等［14］在視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞中構(gòu)建EMT模型，發(fā)現(xiàn)自噬水平顯著升高，而在該種細(xì)胞中通過敲除ATG7構(gòu)建自噬缺陷模型后，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞失去了上皮細(xì)胞表型，說明自噬能夠有效抑制視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞中的EMT并加強(qiáng)細(xì)胞間連接。BAEK等［15］發(fā)現(xiàn)在視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞中，KRT8和自噬水平升高能夠抑制氧化應(yīng)激引起的EMT，并阻止細(xì)胞死亡。WU等［16］發(fā)現(xiàn)在TGF-β誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞EMT模型中，自噬的水平顯著升高，而雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬水平升高能進(jìn)一步加強(qiáng)視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞中的EMT水平。此結(jié)論與FENG等［14］的結(jié)論相反，說明自噬與EMT之間的相互作用關(guān)系十分復(fù)雜，即使在同一種細(xì)胞系中，不同的影響條件也會得出不同的結(jié)論。

疾病的發(fā)生不是單一的生物學(xué)過程，自噬和EMT水平的異常都能導(dǎo)致晶狀體發(fā)育異常和白內(nèi)障的形成，因此將二者結(jié)合研究對于維持晶狀體上皮細(xì)胞的正常生長和分化是十分有意義的。本實(shí)驗(yàn)首次在人晶狀體上皮細(xì)胞中將自噬相關(guān)基因與EMT水平聯(lián)系起來，為研究白內(nèi)障的形成提供了新的方向。

以往研究［17-18］認(rèn)為ATG4A基因具有ROS依賴性，細(xì)胞內(nèi)ROS的水平可以極大影響ATG4A的表達(dá)，然而本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ATG4A的人晶狀體上皮細(xì)胞中，ROS水平與NC組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明ATG4A無法直接影響正常生長的晶狀體上皮細(xì)胞中ROS的水平，但是ATG4A在病理?xiàng)l件下能否影響ROS的水平還需進(jìn)一步探索。

綜上所述，ATG4A對于晶狀體上皮細(xì)胞的EMT水平具有促進(jìn)作用，但無法直接影響細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。本研究利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建ATG4A過表達(dá)的人晶狀體上皮細(xì)胞模型，探索了ATG4A對人晶狀體上皮細(xì)胞表型的影響，初步論證了ATG4A在晶狀體發(fā)育和白內(nèi)障形成過程中的作用。