姜麗莉 王靜 李振鳳 周齊 欒雪靜 任新雯

摘要：目的? 探討甲巰咪唑?qū)Τ踉\Graves'病患者血清相關(guān)細(xì)胞因子及microRNAs（miRNAs）水平的影響。方法? 選取2016年12月～2019年1月于海陽市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科就診的36例Graves'病初診患者為疾病組，給予甲巰咪唑治療。另選取同期30例健康志愿者作為健康對照組。比較疾病組治療前、治療后及健康對照組甲狀腺功能指標(biāo)[游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、游離甲狀腺素（FT4）、促甲狀腺激素（TSH）、促甲狀腺激素受體抗體（TRAb）]、細(xì)胞因子[IL-2、IL-6、IL-17、TGF-β1]、hs-CRP、microRNAs[miR-16、miR-142-3p、miR-146a、miR-155]的水平。結(jié)果? 疾病組治療前FT3、FT4，TRAb，IL-6、IL-17、TGF-β1、hs-CRP，miR-16、miR-142-3p、miR-155水平高于健康對照組，TSH、IL-2及miR-146a水平低于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。疾病組治療后FT3、FT4、TRAb、IL-6、TGF-β1、hs-CRP、miR-16、miR-142-3p、miR-155水平低于治療前，而TSH、IL-2、miR-146a水平高于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;IL-17水平治療前后比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。疾病組治療后TSH、IL-2、miR-146a水平低于健康對照組，IL-6、IL-17、TGF-β1、hs-CRP、miR-16、miR-155水平高于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），兩組FT3、FT4、TRAb及miR-142-3p水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義表（P>0.05）。結(jié)論? 甲巰咪唑可改善Graves'病患者的甲狀腺功能，血清相關(guān)細(xì)胞因子及miRNAs可作為該病臨床診療的輔助指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：Graves'病;甲巰咪唑;細(xì)胞因子;microRNAs

中圖分類號(hào)：R511.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.08.031

文章編號(hào)：1006-1959（2020）08-0101-04

Abstract：Objective? ? To investigate the effect of methimazole on serum-related cytokines and microRNAs（miRNAs） in newly diagnosed Graves' disease patients.Methods? From December 2016 to January 2019，36 newly diagnosed patients with Graves' disease who were treated in the Department of Endocrinology of Haiyang People's Hospital were selected as the disease group and treated with thiamazole.Another 30 healthy volunteers in the same period were selected as the healthy control group.Comparision of thyroid function indexes before treatment ，after treatment of disease group and healthy control group[free triiodothyronine（FT3）， free thyroxine（FT4）， thyroid stimulating hormone（TSH），thyrotropin receptor antibody （TRAb）]，Cytokines [IL-2，IL-6，IL-17，TGF-β1]，hs-CRP，microRNAs[miR-16，miR-142-3p，miR-146a，miR-155].Results? Before treatment，the levels of FT3，F(xiàn)T4，TRAb，IL-6，IL-17，TGF-β1，hs-CRP，miR-16，miR-142-3p，and miR-155 were higher than those of healthy controls，TSH，IL- 2 and miR-146a levels were lower than the healthy control group，the difference was statistically significant（P<0.05）.After treatment，the levels of FT3，F(xiàn)T4TRAb，IL-6， TGF-β1，hs-CRP，miR-16，miR-142-3p，and miR-155 were lower than before treatment，the levels of TSH，IL-2 and miR-146a were higher than before treatment，the difference was statistically significant（P<0.05）; the IL-17 level before and after treatment had no significant difference（P>0.05）. After treatment，the levels of TSH，IL-2，miR-146a in the disease group were lower than those in the healthy control group，IL-6，IL-17，TGF-β1，hs-CRP， miR-16，miR-155 were higher than the healthy control group，the difference was statistically significant（P<0.05）. There was no statistically significant difference in FT3，F(xiàn)T4，TRAb and miR-142-3p levels between the two groups（P>0.05）. Conclusion? Thiamazole can improve thyroid function in patients with Graves' disease.Serum-related cytokines and miRNAs can be used as auxiliary indicators for clinical diagnosis and treatment of this disease.

Key words：Graves' disease;Methimazole;Cytokines;microRNAs

Graves'?。╣raves' disease，GD），又稱毒性彌漫性甲狀腺腫，是一種器官特異性自身免疫性疾病，是甲狀腺功能亢進(jìn)癥最常見的類型，約占甲亢的85%。近年來GD發(fā)病率逐年升高，并呈現(xiàn)年輕化趨勢[1]。該病臨床主要表現(xiàn)為高代謝癥候群、彌漫性甲狀腺腫、眼征、皮損及脛前粘液性水腫。針對該病，目前主要治療方法包括抗甲狀腺藥物、放射性核素碘、手術(shù)及介入栓塞。其中以抗甲狀腺藥物療法最為安全方便，且治療過程中不會(huì)造成永久性甲減而得到廣泛應(yīng)用。抗甲狀腺藥物中甲巰咪唑因安全性相對較好、藥效穩(wěn)定、半衰期長、患者的依從性較好而被推薦作為臨床治療甲亢的首選藥物[2]。有研究表明，表觀遺傳、環(huán)境和免疫學(xué)因素在GD發(fā)病機(jī)制發(fā)病中起著重要作用，多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子共同參與了GD的發(fā)病，尤其是T淋巴細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子，如IL-2、IL-6、IL-17、TGF-β1[3]。除細(xì)胞因子外，miRNAs直接或間接參與了固有性及適應(yīng)性免疫應(yīng)答，從而可能在自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的負(fù)調(diào)控作用。越來越多的研究證實(shí)，miRNAs異常與GD的發(fā)生密切相關(guān)，研究較多的有miR-16、miR-142-3p、miR-146a 及miR-155[4]。本研究通過檢測IL-2、IL-6、IL-17、TGF-β1等細(xì)胞因子、hs-CRP及miR-16、miR-142-3p、miR-146a 及miR-155等miRNAs的表達(dá)水平，觀察甲巰咪唑治療GD病的臨床效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料? 選取2016年12月～2019年1月于海陽市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科就診的36例Graves'病初診患者為疾病組，疾病組男性7例，女性29例;年齡19～68歲，平均年齡（38.41±11.81）歲，另選取同期30例健康志愿者為健康對照組，其中男性6例，女性24例;年齡18～60歲，平均年齡（39.06±11.17）歲。兩組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。疾病組患者均符合2008版《中國甲狀腺疾病治療指南》中GD病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，無手術(shù)治療史及合并嚴(yán)重心肺功能不全。健康對照組無新近感染，且無甲狀腺疾病和家族史。所有研究對象均排除感染、妊娠、腫瘤、過敏性疾病以及其它免疫性疾病，6個(gè)月內(nèi)均未使用激素及免疫抑制劑。所有參與者均簽署書面知情同意書。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本收集? 所有研究對象均于清晨空腹采集肘部靜脈血5 ml，3000 r/min 離心10 min，分離血清并分裝，-80℃保存待測。

1.2.2甲狀腺功能相關(guān)指標(biāo)測定? 采用BECKMAN COULTER UniCel DXI800全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀與配套試劑對所有研究對象進(jìn)行FT3、FT4以及TSH定量測定。采用羅氏Cobas e411電化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀與配套試劑對TRAb進(jìn)行定量測定。具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 hs-CRP測定? 采用免疫透射比濁法進(jìn)行hs-CRP的檢測。選用BECKMAN COULTER AU5800全自動(dòng)生化儀及伊普諾康生物試劑盒，檢測步驟參照說明書進(jìn)行。

1.2.4細(xì)胞因子的測定 以 IL-2測定為例，應(yīng)用Human IL-2 ELISA Kit（聯(lián)科生物）進(jìn)行濃度定量測定，檢測方法為ELISA，檢測步驟參照說明書。繪制血清樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用Thermo Scientific multiskan go全波長酶標(biāo)儀在450 nm及570 nm處進(jìn)行雙波長吸光值測定并計(jì)算待測細(xì)胞因子濃度。IL-6、IL-17、TGF-β1檢測步驟同上。

1.2.5 miRNAs的測定? ①RNA提?。翰捎肨rizol法提取血清樣本中的總RNA。取-80℃保存的血清200 μl，加1 ml Trizol混合均勻，提取過程參照說明書。提取的總RNA應(yīng)用Nanodrop OneC超微量可見分光光度計(jì)檢測其在波長260 nm及280 nm 處的吸光度比值以驗(yàn)證其純度。②逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR：將提取的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以U6為內(nèi)參，反轉(zhuǎn)錄過程參照Takara PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）說明書，反應(yīng)條件：42℃ 15 min，85℃ 5 sec，4℃保存。熒光定量PCR按照QIAGEN QuantiNova? SYBR? Green PCR說明書進(jìn)行，反應(yīng)條件為95℃ 2 min，95℃ 5 sec，60℃ 10 sec，40個(gè)循環(huán)。

1.3觀察指標(biāo)? 比較疾病組治療前、治療后及健康對照組甲狀腺功能指標(biāo)[游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、游離甲狀腺素（FT4）、促甲狀腺激素（TSH）、促甲狀腺素受體抗體（TRAb）]、細(xì)胞因子[IL-2、IL-6、IL-17、TGF-β1]、hs-CRP、microRNAs[miR-16、miR-142-3p、miR-146a、miR-155]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用（n）表示，計(jì)量資料采用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1甲狀腺功能指標(biāo)水平? 疾病組治療前FT3、FT4，TRAb水平高于健康對照組，TSH水平低于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;疾病組治療后FT3、FT4以及TRAb水平低于治療前，TSH水平高于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;疾病組治療后TSH水平低于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），兩者FT3、FT4、及TRAb水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.2血清細(xì)胞因子及hs-CRP水平? 疾病組治療前IL-6、IL-17、TGF-β1及hs-CRP水平高于健康對照組，IL-2水平低于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。疾病組治療后IL-2水平高于治療前，IL-6、TGF-β1、hs-CRP水平低于治療前，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），治療前后IL-17水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;疾病組治療后IL-6、IL-17、TGF-β1及hs-CRP水平高于健康對照組，IL-2水平低于健康對照組（P<0.05），見圖1。

2.3 miRNAs的表達(dá)水平? ?疾病組治療前miR-16、miR-142-3p、miR-155水平高于健康對照組，miR-146a水平低于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;疾病組治療后miR-16、miR-142-3p及miR-155水平低于治療前，miR-146a水平高于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;疾病組治療后miR-16、miR-155水平高于健康對照組，miR-146a水平低于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），兩者miR-142-3p水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖2。

3討論

目前，臨床上GD治療主要依據(jù)血清中甲狀腺激素水平的變化，然而后者的指示作用存在一定局限性。多項(xiàng)研究證明，細(xì)胞因子及miRNAs在GD發(fā)病過程中起著重要的調(diào)節(jié)及介導(dǎo)作用。故本文通過測定血清中細(xì)胞因子及miRNAs在甲巰咪唑治療前后表達(dá)水平的變化，探究其在GD診療中的作用。甲巰咪唑是目前臨床上治療GD的主要藥物之一，具有抑制甲狀腺腺泡內(nèi)過氧化物酶、阻礙T3、T4合成及輕度的免疫抑制作用。本研究顯示，GD患者在經(jīng)甲巰咪唑治療6個(gè)月后，F(xiàn)T3、FT4以及TRAb水平均低于治療前，而TSH水平高于治療前，說明甲巰咪唑可抑制甲狀腺激素的合成，改善患者的甲狀腺功能。

GD通常被認(rèn)為與遺傳、外界環(huán)境變化以及自身免疫系統(tǒng)異常有關(guān)。免疫系統(tǒng)異常主要是免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子失衡。IL-2水平增高通?？梢蕴崾灸撤N自身免疫性疾病。IL-6可增加T細(xì)胞表達(dá)IL-2及IL-2受體（IL-2R），并參與刺激免疫反應(yīng)的細(xì)胞增殖、分化及自身抗體產(chǎn)生[5]。IL-17是一種強(qiáng)大的前炎癥細(xì)胞因子，通過促進(jìn)炎癥因子分泌將中性粒細(xì)胞招募至炎癥部位形成炎癥反應(yīng)，并參與介導(dǎo)自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[6]。hs-CRP常作為炎性反應(yīng)的一個(gè)重要指示[7]。本研究中，疾病組治療前IL-6、IL-17、TGF-β1及hs-CRP較健康對照組表達(dá)升高，IL-2降低，說明這些細(xì)胞因子可能參與了GD發(fā)生并促進(jìn)其發(fā)展。治療后，IL-6、IL-17、TGF-β1及hs-CRP較治療前降低，IL-2升高，說明甲巰咪唑具有免疫抑制作用。而IL-17水平變化不明顯，這可能與甲巰咪唑不能抑制外周血中IL-17分泌有關(guān)。同時(shí)，GD患者治療后盡管甲狀腺功能回歸正常，但機(jī)體免疫失衡依舊存在。

大量研究表明，miRNAs在自身免疫疾病的發(fā)生中起關(guān)鍵作用，大多參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分化或激活免疫反應(yīng)，但其與GD相關(guān)的研究還很少[8]。miR-16可參與炎癥因子及趨化因子生成[9]，miR-142-3p削弱了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T cells，簡稱Tregs）對CD4+CD25T細(xì)胞增殖反應(yīng)和細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制作用。既往文獻(xiàn)證實(shí)GD患者Treg細(xì)胞抑制功能受損[10]，說明miR-146a可能參與CD4+T細(xì)胞功能異常，進(jìn)而影響炎癥發(fā)展[11]。miR-155被認(rèn)為與天然免疫應(yīng)答密切相關(guān)，其表達(dá)失調(diào)可引起炎癥及多種自身免疫性疾病。本研究中發(fā)現(xiàn)miR-16、miR-142-3p、miR-146a及miR-155表達(dá)水平在治療前后均發(fā)生了顯著變化，疾病組治療前miR-16、miR-142-3p、miR-155水平高于健康對照組，miR-146a水平低于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;疾病組治療后miR-16、miR-142-3p及miR-155水平低于治療前，miR-146a水平高于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;疾病組治療后miR-16、miR-155水平高于健康對照組，miR-146a水平低于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），兩者miR-142-3p水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明上述miRNAs可能在GD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可能通過損害GD患者的CD4+T細(xì)胞功能而加重免疫功能亢進(jìn)。同時(shí)，甲巰咪唑治療后，miRNAs較治療前有顯著性差異，表明miRNAs可能是甲巰咪唑治療GD的作用機(jī)制之一。

綜上，甲巰咪唑可改善GD病患者的甲狀腺功能，血清相關(guān)細(xì)胞因子及miRNAs可作為GD病臨床診療的輔助指標(biāo)。

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收稿日期：2020-03-03;修回日期：2020-03-17

編輯/李國苗