王 蕾，楊寶良，魏 威，周 培，劉海生，李潤樂，湯 鋒*

(1.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810001；2.青海省紅十字醫(yī)院，青海 西寧 810001；3.青海大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，青海 西寧 810001；4.青海大學(xué)研究生院，青海 西寧 810001)

亮氨酸氨基肽酶是一種金屬肽酶，它在微生物、哺乳動(dòng)物和植物中廣泛存在并具有特定的作用[1]；M17氨基肽酶家族(M17-LAP)被證實(shí)它在許多寄生蟲感染中起到了保護(hù)宿主的作用。在寄生蟲感染過程中，寄生蟲來源的蛋白酶是影響寄生蟲生理功能和致病性的關(guān)鍵因素，如蛋白質(zhì)分解代謝、營養(yǎng)物質(zhì)獲取和寄生蟲在宿主體內(nèi)的遷移、組織入侵、免疫逃避及在宿主體內(nèi)的存活等[2]。這些蛋白酶已被開發(fā)為控制各種寄生蟲感染的靶點(diǎn)藥物、候選疫苗和血清診斷標(biāo)志物。因此本研究主要通過構(gòu)建pCzn1-LAP質(zhì)粒表達(dá)蛋白，通過分離純化獲取目的蛋白為后續(xù)多房棘球蚴LAP行優(yōu)勢抗原表位鑒定，及評價(jià)LAP對多房棘球蚴感染是否具有保護(hù)作用奠定基礎(chǔ)。行酶學(xué)作用條件分析可為研制抗蟲藥物和疫苗提供有價(jià)值的應(yīng)用信息。

1.材料與方法

1.1 主要試劑

pCzn1質(zhì)粒(鐘鼎生物公司)，限制性內(nèi)切酶(TaKaRa公司)，蛋白質(zhì)Marker(Thermo公司)，IPTG(Sigma公司)，質(zhì)粒小提試劑盒(AXYGEN公司)，大腸桿菌BL-21感受態(tài)細(xì)胞(鐘鼎生物公司)，氨芐青霉素鈉(Solarbio公司)，MD34透析袋(Solarbio公司)，Ni2+IDA親和層析柱(Novagen公司)。亮氨酸對硝基苯胺(Sigma公司)，甘氨酸(Amresco公司)。

氯化物為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 pCzn1-LAP質(zhì)粒構(gòu)建

參照文獻(xiàn)方法實(shí)驗(yàn)[3]。LAP蛋白的氨基酸序列通過NCBI-GenBank網(wǎng)站獲取，序列號(hào)為CDS36608.1，含有1796個(gè)堿基，編碼519個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)理論分子量大小為57 KD。利用OptimumTMCodon軟件進(jìn)行密碼子優(yōu)化，獲得最優(yōu)的堿基序列(適合蛋白質(zhì)原核表達(dá))[4]。采用基于PCR精確合成的方法，設(shè)計(jì)全長拼接引物合成LAP基因，添加兩個(gè)酶切位點(diǎn)，并在引物的兩端分別設(shè)計(jì)了保護(hù)性堿基，連入載體pCzn1。將獲得的重組質(zhì)粒pCzn1-LAP轉(zhuǎn)入BL-21克隆菌株，將陽性產(chǎn)物進(jìn)行測序并進(jìn)行序列比對。主要酶切鑒定體系組成包括質(zhì)粒3 μL，內(nèi)切酶NdeI和XbaI各0.25 μL，10×Buffer 1 μL和DDW 10 μL。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

提取陽性菌株的質(zhì)粒后進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。將16 μL的IPTG(50mg/mL)和40 μL的X-gal(20mg/mL)加入預(yù)先準(zhǔn)備的LB固體培養(yǎng)平板(Ampicillin 50μg/mL)中，用玻璃珠均勻涂布，在37 ℃恒溫箱靜置1 h[4]。將3 μL的pCzn1-LAP質(zhì)粒加入60 μL的BL-21感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻后放入冰盒30 min，于42 ℃熱激90 sec后迅速置冰中5 min，加入300 μL的LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)1 h[5]。培養(yǎng)完成的菌液均勻涂布于上述固體平板，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)(過夜)，10 h后從平板中挑取單個(gè)白色陽性菌置于5 mL的LB液體培養(yǎng)基(Ampicillin 50μg/mL)中發(fā)酵[5]，將用12%SDS-PAGE電泳驗(yàn)證后的菌液加入甘油置-80 ℃冰箱儲(chǔ)存。

1.2.3 LAP原核表達(dá)及純化

利用低壓層析系統(tǒng)進(jìn)行融合蛋白的Ni柱親和純化，用PBS沖洗(恒流泵流速設(shè)置為30左右)平衡柱至OD280值為0。蛋白樣品加入已經(jīng)平衡好的親和層析柱，用Washing-Buffer(10mM Tris-HCl，50mM NaH2PO4，10mM咪唑，8M尿素。pH8.0)洗脫雜蛋白[3]，用Elution-Buffer(10mM Tris-HCl，50mM NaH2PO4，250mM咪唑，8M尿素。pH8.0)洗脫并接收LAP蛋白[3]。用PEG20000濃縮蛋白至淡黃色時(shí)行電泳分析[3]。

1.2.4 LAP酶學(xué)特征分析

以Leu-pNA為底物測定LAP酶活性，在405 nm處測定吸光度值的大小(代表酶活性的大小)[6]。在不同的緩沖液中(甘氨酸緩沖液pH 2.7、磷酸鈉緩沖液pH 4.5～7.5、Tris-HCl緩沖液pH 8.0～10.0和1M Tris-HCl緩沖液pH 10.5～11.0)行最適pH值測定[7]。在96孔板中，加入80 μL的LAP蛋白、20 μL的Leu-pNA(10mM)，再加入100 μL的緩沖液，于60 ℃條件下孵育2 h。對照組用等量的純水代替LAP蛋白。最后將96孔板置于冰上冷卻10 min使反應(yīng)停止，用酶標(biāo)儀測定405 nm處的吸光度值。

觀察4 ℃～75 ℃間LAP最佳酶活性溫度條件。在96孔板中，加入80 μL的LAP蛋白、20 μL的Leu-pNA(10mM)，再加入100 μL的50 mM的Tris-HCl緩沖液(pH=9)，不同溫度條件下孵育2 h。對照組用等量的純水代替LAP蛋白。

將10 mM不同的金屬氯化物(包括BaCl2、CaCl2、CoCl2、MnCl2、MgCl2、ZnCl2)分別加入到反應(yīng)體系中，測定金屬離子對LAP酶活性的影響[7]。在96孔板中，加入80 μL的LAP蛋白、10 μL的不同金屬氯化物，再加入90 μL的50 mM的Tris-HCl緩沖液(pH=9)，于30 ℃條件下孵育30 min，最后加入20 μL的Leu-pNA(10mM)，于60 ℃條件下孵育2 h。對照組用等量的純水代替LAP蛋白。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

測定不同金屬離子對LAP酶活性大小的影響時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對照組的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 pCzn1-LAP測序及比對結(jié)果

將重組質(zhì)粒pCzn1-LAP轉(zhuǎn)入BL-21克隆菌株，挑取的陽性克隆子的測序結(jié)果和預(yù)期序列完全一致。圖1為部分測序比對結(jié)果。測序結(jié)果拼接如下所示，單劃線區(qū)域?yàn)長AP基因區(qū)域，黃色區(qū)域表示酶切位點(diǎn)。

TCGTAGTGCACATTCCTTTAACGCTTCAAAATCTGTAAAGCACGCCATATCGCCGAAAGGCACACTTAATTATTAAGAGGTAATACACCATGAATCACAAAGTGCATCATCATCATCATCATATGTCCCACATCCTTCTTATGTACCTTAAGAGCTGCTCACGTATCGCTGATGCTGACTGCGATATCGTTGTCTTCGTGAATGACGCAATTCGCTCTCTGGGATCGTCTCTTTTTGCCCTGGAACAGGCCCTTGCCGTCTTTGAAAAGGTTAATCCGAAATTATCGGAGAGTTGCGATCTTATTCCATTCCCAAATCATCCGTGTCAGCGTCTGATTTTCGCACCCACCGGAAAGCTGGATGGGGATACAGCCGACAGCCGTAATATTTCGGATGCCGCGTTTAAGGCTATCAAGATGGCGCATTGCATCGGGTGCCGCCGTCCTTTATTAGTTCTTGGCGGGATCGCAAGTGGACCCAAGGACGCCTTATGGATGGAGAGCGAATTCCCGTTGTTGAACGCTATCTTAGGTGCTCTGCATGCCTTATATAATCCCTTAGAACTGTGCGAAGCGTTCCCGGAGAAGGCGCGTAAGTTTGACAACTTGTTGGTTTTCGGAGCATCGGAACGCATTTTGCGCGTTGCGTATGCTATGGAAGAAGGTCGCCGTGTTGCTCGTGACATCGCCGGGAGTGACCCAGAACGCATGAGTGCTCCTCGCATCGTGGAGTATCTGAAGCGCGAGTTTGCCAGCACGCCAGAGGTCATTATGCATGTTAAAGAAATCGACACGTCCGCATACCCGTTAATTGCTGCTGTGAATCGTGCGGCGAGTGGCGTTGAACGTCATAATGGAAAAGTAGTACACCTTACCTATGAGGGCGGCTCCCCGGTCGATACTACTTTATTTCTGATCGGCAAAGGAATTACGTATGATACCGGCGGCACCGATGTGAAGGCTGGAGGCGTTATGGCCGGAATGCATCGTGACAAAAGTGGAGCCGCAGCTGTCGCGGGTTTTTTCCGCACTTTGTCCCTTCTTAAACCGAAGGGTCTTTCCGTTCATGGAGCTATGGCTCTTGTACGCAATTCAATTGGATGTGACGGTTATGTCGCCGACGAAATCATTACGTCCCGTGCCGGACGCCGCGTACGCGTGGGAAACACGGATGCTGAGGGTCGCATGGTAATGACCGACTTATTATGCGAGGCTAAAGAACAGGCAATGAATGCGGTGAACCCATTTTTGTTCACATTTGCTACATTAACGGGTCATGCTGCGCTGGCATATTCCTGCTATACCGCGATCATGGATAATGGCCCCGCGCACAAGCAGGGGGTTGCTTCGGACCTTCAGCGCGCAGGTGACCAAGTCTCAGATATGGCCGAGATTTCTACAATCCGCCGCGAGGACTACGAAGCTGTAAAGGGACACTCGGAGTACGAAGACTTGCTGCAATGCAATAATCTGCCCAGTTCCGCCACCCCACGCGGTCACCAGTTTCCGGCCGCATTTATGATTGCGGCAAGTGGTCTTGATGAGCACGGGTTAGGCTCGGAACAAAAACATTTACCCTACACTCACCTTGATATCGCCGGGAGCGCCGGTGCTATTGATGTATTACCCACAGGCGCTCCCTTACTGATGTTTACCTCCATGTACATCCTGCCCCGCCTTTAATCTAGATAGGTAATCTCTGCTTAAAAGCACAGAATCTAAGATCCCTGCCATTTGGCGGGGATTTTTTTATTTGTTTTCAGGAAATAAATAATCGATCGCGTAATAAAATCTATT

圖1 pCzn1-LAP測序結(jié)果圖

2.2 酶切鑒定PCR結(jié)果

pCzn1-LAP質(zhì)粒經(jīng)過酶切后，PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。與質(zhì)粒酶切前DNA擴(kuò)增電泳結(jié)果比較，酶切后在4.4 Kbp大小左右處出現(xiàn)了清晰明亮的目的條帶，說明質(zhì)粒的雙酶切成功。

M：DNA Marker；1：酶切前的質(zhì)粒；2：酶切后的質(zhì)粒

2.3 載體構(gòu)建圖譜

重組質(zhì)粒pCzn1-LAP載體構(gòu)建圖譜如圖3所示。圖3顯示該質(zhì)粒具有氨芐青霉素抗性。此發(fā)現(xiàn)為下一步原核蛋白表達(dá)研究提供了前置條件。

2.4 LAP表達(dá)及純化結(jié)果

LAP蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)成功建立，通過IPTG誘導(dǎo)后，菌液表達(dá)產(chǎn)量大幅增加，沉淀中表達(dá)的蛋白比上清液多(圖4)。通過親和層析柱后蛋白獲得純化，LAP蛋白的分子量為57 KD(含組氨酸標(biāo)簽)(圖5)。

圖3 pCzn1-LAP質(zhì)粒載體構(gòu)建示意圖

M：Marker；1：未誘導(dǎo)；2：誘導(dǎo)后；3：0.5 mM IPTG誘導(dǎo)上清；4：0.5 mM IPTG誘導(dǎo)沉淀

M：Marker；1：未純化；2：洗脫液中的蛋白；3：目的蛋白

2.5 LAP酶學(xué)特征分析結(jié)果

LAP蛋白酶活性最適pH在7.5～9.0間，當(dāng)pH為9.0時(shí)LAP酶活性最高(圖6A)。LAP蛋白酶活性最適溫度在45 ℃～60 ℃間，當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)LAP酶活性最高(圖6B)。與對照組比較，LAP實(shí)驗(yàn)組不同金屬離子對其活性均有影響(P<0.001)。當(dāng)Co2+、Zn2+存在時(shí)，LAP酶活性顯著增強(qiáng)；不同金屬離子對酶活性影響大小排序?yàn)镃o2+>Zn2+>Ca2+>Mn2+>Mg2+>Ba2+>K+(圖6C)。

A：pH的影響；B：溫度的影響；C：金屬離子的影響

3.討論

重組蛋白的表達(dá)與純化在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和藥學(xué)研究等領(lǐng)域占有重要地位，重組DNA技術(shù)通過簡單的修飾能夠改變蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、活性和功能，通過親和標(biāo)記可以促進(jìn)蛋白質(zhì)純化[8]。研究表明密碼子基因優(yōu)化后的蛋白質(zhì)更利于表達(dá)且產(chǎn)量高[9]。本研究采用基因合成方法利用遺傳密碼子的偏愛性優(yōu)化來促進(jìn)重組靶蛋白LAP的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)LAP以包涵體形式表達(dá)，因此需要通過復(fù)性步驟以及優(yōu)化培養(yǎng)條件(包括誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間和溫度)減少包涵體生成。本實(shí)驗(yàn)最終選定IPTG誘導(dǎo)濃度為0.5 mM，培養(yǎng)溫度為37 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間為4 h。

通過酶學(xué)特征分析發(fā)現(xiàn)，多房棘球蚴抗原LAP具有M17-LAP家族的特點(diǎn)，可以與亮氨酸特異性底物L(fēng)eu-pNA發(fā)生反應(yīng)。研究表明，M17-LAP通過金屬離子與活性位點(diǎn)結(jié)合發(fā)揮效應(yīng)[10]，通過測定不同金屬離子對LAP酶活性影響，能夠?yàn)楹罄m(xù)研究其活性位點(diǎn)、底物/抑制劑結(jié)合模式和作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Co2+、Zn2+存在時(shí)，LAP酶活性提高，說明它是金屬依賴型蛋白酶。對蛋白晶體結(jié)構(gòu)的研究顯示，Zn2+在M17-LAP活性位點(diǎn)中起到了調(diào)節(jié)和催化作用[11]，Zn2+是否結(jié)合LAP的活性位點(diǎn)發(fā)揮作用尚需驗(yàn)證。目前關(guān)于LAP酶活性的最適pH值和最適溫度大部分集中在8.0～9.5和45 ℃～75 ℃之間[6，7，12]，本實(shí)驗(yàn)測定的多房棘球蚴LAP的最適pH和最適溫度結(jié)果也在此范圍內(nèi)，說明它具有一定的耐高溫的能力，不易發(fā)生降解。由此推測在堿性和高溫環(huán)境下可能有利于LAP疏水核與N末端未質(zhì)子化的底物之間相互作用，從而促進(jìn)底物的水解。上述多房棘球蚴LAP酶學(xué)特征的相關(guān)研究結(jié)果可能為后續(xù)尋找其活性位點(diǎn)和金屬離子結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)鍵特征，以及研究側(cè)鏈基團(tuán)的功能、抑制劑結(jié)合模式奠定基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)通過將多房棘球蚴抗原LAP的重組基因與表達(dá)載體pCzn1相連接，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL-21菌株中進(jìn)行表達(dá)，成功構(gòu)建了LAP的原核表達(dá)系統(tǒng)。LAP融合蛋白通過Ni柱親和層析后純度變高。酶活性分析證實(shí)，多房棘球蚴LAP屬于M17-LAP家族，LAP可以作為藥物治療或疫苗干預(yù)的一個(gè)有吸引力的靶點(diǎn)。