趙 琳，王學(xué)紅，安 琪，李春霞，王 昀，李蘇華，馬雪芹，郜 茜，綻永華，楊生森，李源化

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院，青海 西寧 810001)

胃腺癌(Gastric adenocarcinoma)的發(fā)病機制尚不明確，目前認(rèn)為是由遺傳因素、生物因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。遺傳學(xué)是腫瘤的研究基礎(chǔ)，隨著對腫瘤機制研究的不斷深入，人們認(rèn)識到腫瘤基因表達(dá)模式的改變不僅包含遺傳學(xué)改變而且包含了更多的表觀遺傳學(xué)改變，表觀遺傳學(xué)改變在腫瘤的啟動和進展中發(fā)揮著比遺傳學(xué)更為重要的作用，因此表觀遺傳學(xué)的提出為腫瘤研究者帶來了新的思路。表觀遺傳是沒有DNA序列變化的可隨細(xì)胞分裂而遺傳的基因組修飾或基因表達(dá)調(diào)控，包括DNA甲基化、組蛋白修飾等，這種基因序列不變而基因表達(dá)改變的作用機制在多細(xì)胞生物的發(fā)育中至關(guān)重要[1]，并能確?；虮磉_(dá)發(fā)生在正確的“時間”和“地點”[2]。DNA甲基化已經(jīng)成為表觀遺傳學(xué)重要研究內(nèi)容和國內(nèi)外研究的熱點。大量研究揭示了轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)基因(transforming growth factorβ induced gene，TGFβⅠ)具有為抑癌因子或腫瘤啟動因子的雙重角色作用[3]。青海是我國胃癌高發(fā)區(qū)[4]，其高發(fā)病率的確切機制尚不明確。本研究應(yīng)用MethPrimer在線平臺預(yù)測TGFβⅠ所富含CpG島(共計15個CpG位點)的序列；利用亞硫酸氫鹽測序(bisulfite sequencing PCR，BSP)法，對青海地區(qū)28例胃腺癌患者TGFβⅠ基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)進行檢測，初步探討TGFβⅠ基因甲基化與青海地區(qū)胃腺癌發(fā)生的相關(guān)程度。

1.對象及方法

1.1 一般資料

選擇2019年3月至11月期間在青海大學(xué)附屬醫(yī)院住院經(jīng)胃鏡及病理首次確診的28例胃腺癌病例為研究對象，收集患者的臨床病理資料，在行胃鏡檢查時取胃腺癌組織、配對癌旁組織樣本各28個；男性18例，女性10例。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

①由胃鏡確診的胃癌患者；②在青海生活逾20年者；③未行放化療；④未患有影響本研究結(jié)果的其他疾患；⑤所有研究對象均簽署知情同意書，且通過青海大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號：XHK-2017-SKJT-001)。

1.3 研究步驟

①胃癌組織及癌旁組織DNA提?。喊碋zup柱式組織基因組DNA抽屜試劑盒(B518251，上海生工)說明書步驟進行。②DNA亞硫酸氫鈉修飾：將各標(biāo)本的DNA(20μL)依照修飾試劑盒說明書進行。③引物設(shè)計、PCR擴增：應(yīng)用MethPrimer在線平臺預(yù)測TGFβⅠ基因(序列總長度：2040bp)；CpG島預(yù)測結(jié)果：共發(fā)現(xiàn)1個CpG島(長度111bp)，位于1875～1985 bp。其中包含有15個CpG位點。引物由上海生工生物公司設(shè)計，PCR擴增引物序列：上游引物TAAGGGTTGGGAAAATTGAGTA；下游引物CCCRAACCAAATTAAATAAACTAC。PCR反應(yīng)條件：在95 ℃下預(yù)變性3～5 min；在94 ℃下變性30 sec；在55 ℃～60 ℃內(nèi)退火25～30 sec；在72 ℃下延伸30～50 sec，將2～4環(huán)節(jié)做35個循環(huán)；在72 ℃下修復(fù)延伸5～8 min。④電泳檢測條帶：取PCR產(chǎn)物5 μL行1%瓊脂糖凝膠電泳(150V，100mA，10～20min)觀察。⑤連接反應(yīng)體系組成：1 μL10Ligation Buffer，1 μL50%PEG，50 ng pUCmT Vector，0.2 pmolPCR Product，x μLH20，2.5 U T4 DNA Ligase，10 μL Final Volume〔按試劑盒說明書轉(zhuǎn)化步驟制備感受態(tài)細(xì)胞(SK9307)〕。⑥ 藍(lán)白斑篩選：將IPTG/X-gal平板上的白色菌落在含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基過夜(37℃)。最后采用3%糖凝膠電泳檢測法，對目的片段TA克隆的菌落行PCR鑒定。⑦測序。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析。兩樣本率的比較、分析采用χ2檢驗法或Fisher確切概率法，視P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 胃腺癌患者癌及癌旁組織中TGFβⅠ基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)

檢測28例胃腺癌及其配對癌旁組織TGFβⅠ基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，總克隆8385個CpG位點(胃腺癌組織：4185；癌旁組織：4200)，其中甲基化陽性克隆771個(胃腺癌組織：478個；癌旁組織293個)。癌組織中平均甲基化率為11.42%；配對癌旁組織中平均甲基化率為6.98%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(表1)。

2.2 TGFβⅠ基因啟動子區(qū)域甲基化與臨床病理特征的關(guān)系

整理28例胃腺癌患者的臨床病理特征資料，進一步分析癌組織中TGFβⅠ基因啟動子甲基化結(jié)果與臨床病理特征之間的關(guān)系。胃腺癌患者癌組織中的TGFβⅠ基因啟動子甲基化率在不同性別、年齡、腫瘤分化程度、浸潤深度、TNM分期患者間未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

表1 胃腺癌患者癌及癌旁組織中的TGFβⅠ甲基化率

表2 胃腺癌組織TGFβⅠ甲基化狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系

3.討論

Feinberg和Vogelstein發(fā)現(xiàn)[5]，在腫瘤中同時存在兩個互相矛盾的表觀遺傳現(xiàn)象，即全基因組低甲基化和局部高甲基化。有研究認(rèn)為[6][7]，全基因組的低甲基化可以導(dǎo)致ras、c-myc等原癌基因激活，而DNA啟動子區(qū)CpG的高甲基化可以導(dǎo)致p16、APC等抑癌基因失活，兩者協(xié)同作用可致腫瘤發(fā)生。TGFβⅠ基因最早是從由TGF-β1刺激的A549肺腺癌細(xì)胞中克隆得到的基因，TGFβⅠ基因存在廣泛，它可由多種類型的細(xì)胞產(chǎn)生，在人膀胱平滑肌和成纖維細(xì)胞中表達(dá)[8]，也可以在腎近端小管細(xì)胞中表達(dá)[9]。作為細(xì)胞外基質(zhì)分子之一，最先被關(guān)注的是其調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附功能和遷移功能。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)TGFβⅠ基因在多種腫瘤中均有表達(dá)，但有關(guān)其作用的報道不一致。有研究認(rèn)為[10]，在腎癌、胰腺癌及結(jié)腸癌中TGFβⅠ基因呈現(xiàn)高表達(dá)，并可誘導(dǎo)、增強腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的能力；與其相反的是[11][12]，在肺癌、乳腺癌細(xì)胞中，TGFβⅠ表達(dá)水平明顯下降或表達(dá)缺失。DNA甲基化，作為最熱門的表觀遺傳學(xué)修飾方式之一，它在細(xì)胞生物學(xué)中有著十分重要的作用。DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的作用下，于胞嘧啶堿(5-甲基胞嘧啶)的碳-5位置加入一個甲基[13]。研究證明基因的表達(dá)結(jié)果會因為DNA甲基化而導(dǎo)致基因沉默致使該基因的表達(dá)降低，抑或是DNA甲基化反而導(dǎo)致基因過度表達(dá)[3]，而這些過度表達(dá)的癌基因可促進腫瘤的發(fā)生[14]。因此，頻繁、連鎖性的DNA高甲基化和DNA低甲基化與腫瘤的產(chǎn)生和腫瘤的進一步發(fā)展可能有著密不可分的關(guān)系。

Han[15]等在對胃癌、肝癌等消化系統(tǒng)腫瘤的研究中用ELISA法測定胃癌患者血清TGFβⅠ水平，得到了患者血清TGFβⅠ水平明顯升高的結(jié)論，考慮異常過量表達(dá)的TGFβⅠ基因可能來源于腫瘤本身，且TGFβⅠ基因過表達(dá)導(dǎo)致自發(fā)性腫瘤發(fā)生率增加，提示在胃癌中TGFβⅠ基因可能扮演的是“癌基因”角色。同時KiichiSugimoto[16]等收集了原發(fā)性胃癌(primarygastriccancers，PGC)及殘胃癌(remnantgastriccancers，RGC)的病例樣本，對全基因組DNA啟動子進行甲基化分析證實了在基因普遍高甲基化組中PGC的貢獻(xiàn)顯著，表明PGC的啟動子甲基化狀態(tài)高于RGC(P=0.004)，這也進一步闡明了PGC與甲基化的關(guān)系。我們的研究應(yīng)用BSP法，檢測28例胃腺癌患者癌組織及其配對癌旁組織中TGFβⅠ基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，并與相關(guān)臨床病理資料進行相關(guān)性分析。本研究結(jié)果顯示，胃腺癌患者癌組織中TGFβⅠ基因啟動子甲基化程度明顯高于癌旁組織(P<0.001)。因此我們的研究也得出了與Kiichi Sugimoto一致的研究結(jié)果，提示TGFβⅠ基因在胃癌中可能作為“癌基因”存在，高甲基化會上調(diào)其表達(dá)，從而參與胃癌的發(fā)生。Shah[10]、YangkiSeok[11]等的研究結(jié)果認(rèn)為DNA高甲基化與腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移、局部侵襲呈正相關(guān)；但我們的研究發(fā)現(xiàn)，胃腺癌患者癌組織中TGFβⅠ基因啟動子甲基化率在不同性別、年齡、腫瘤分化程度、浸潤深度、TNM分期患者間不存在統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。本研究樣本數(shù)有限，需進一步行大樣本研究。

TGFβⅠ基因在胃腺癌中可能為癌基因，其啟動子區(qū)高甲基化狀態(tài)可能與青海胃癌高發(fā)相關(guān)。