張 輝，李爽林，馬 強，楊應忠，李 琳

(1.青海大學醫(yī)學院，青海 西寧 810001；2.青海大學附屬醫(yī)院，青海 西寧 810001；3.青海大學研究生院，青海 西寧 810016)

先天性心臟病(Congenital heart disease，CHD)是由遺傳因素和環(huán)境因素單獨或兩者共同作用引起的。西寧屬高海拔地區(qū)，CHD的總患病率為1.15%，明顯高于我國平原地區(qū)(0.13%～0.35%)[1]。徐等[2]的調查顯示，青海省CHD的發(fā)生率高于國內平原地區(qū)，并且隨海拔的升高，CHD檢出率增高。TBX5是影響心臟發(fā)育的重要影響因子之一，其位于染色體12q24區(qū)，是T-box轉錄因子家族的成員，具有8個外顯子，可編碼518個氨基酸[3]。本研究通過對研究對象TBX5的所有外顯子進行測序和分析，探討TBX5突變與西寧地區(qū)漢族人群先天性心臟病的相關性。

1.對象與方法

1.1 研究對象選擇

收集2016年至2019年就診于青海大學附屬醫(yī)院的220例西寧地區(qū)的漢族CHD患者及220名健康者血液。本次研究通過青海大學醫(yī)學院倫理審查委員會審查，并與所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 樣本收集與DNA提取

抽取受試者外周靜脈血5 mL于EDTA抗凝管中，并用Gentra Puregene Blood Kit血液基因組提取試劑盒(Qiagen，158389，德國)提取基因組DNA。用DU800核酸檢測儀測定DNA濃度，最終將樣品基因組DNA稀釋至200 ng/μL后置-20 ℃冰箱保存。

1.3 外顯子PCR和測序

通過Primer3.0(version0.4.0)軟件為TBX5(NG_007373.1)8個外顯子設計引物(表1)。利用2×TaqPlusPCR(Mastermix，天根，北京)分別擴增8個外顯子序列。PCR總的反應體系：2×TaqPlus為12.5 μL，上游和下游引物各為1 μL，DNA為1 μL，最后加dd水補足至25 μL。PCR的反應過程：94 ℃預變性300秒，94 ℃變性45秒，60 ℃退火45秒，72 ℃延伸45秒，72 ℃終延伸300秒，共計34個循環(huán)。所有樣本基因組DNA經1.5%～2.0%瓊脂糖凝膠電泳40 min，將所有PCR產物經電泳凝膠成像檢驗合格后，統(tǒng)一送至上海美吉生物公司，并用ABI3730基因測序儀對所有PCR產物的反應原液進行雙向測序。結果返回后與NCBI網站提供的TBX5外顯子參考序列進行比對分析。

表1TBX5外顯子引物

1.4 統(tǒng)計學分析

利用Excel2013軟件對樣本群體的代表性進行哈迪-溫伯格遺傳平衡檢驗(HWE)。

2.結果

2.1 哈迪-溫伯格遺傳平衡檢驗結果

研究組的rs201071418、rs780584178、rs200073406和rs149474574的SNP位點符合哈迪-溫伯格遺傳平衡定律(χ2=0.001，P=0.973)。

2.2 8個外顯子部分PCR產物電泳結果

所有外顯子PCR產物電泳條帶清晰，各片斷反應產物的長度大小與所設計的各片斷大小預期值符合，特異性良好(圖1)。

外顯子1PCR產物電泳圖 外顯子2PCR產物電泳圖

外顯子3PCR產物電泳圖 外顯子4PCR產物電泳圖

外顯子5PCR產物電泳圖 外顯子6PCR產物電泳圖

外顯子7PCR產物電泳圖 外顯子8PCR產物電泳圖

2.3 突變位點測序峰圖

對TBX5全部外顯子進行測序分析發(fā)現(xiàn)，研究組中1號外顯子的第93位密碼子堿基(rs780584178)發(fā)生了同義替換(圖2)。7號外顯子的第791位密碼子堿基(rs201071418)發(fā)生了非同義替換(由AGG到AAG，p.R264K)(圖3)。8號外顯子的第1152位密碼子堿基(rs200073406)發(fā)生了同義替換(圖4)。8號外顯子的第1296位密碼子堿基(rs149474574)發(fā)生了同義替換(圖5)。除此之外沒有發(fā)現(xiàn)其他突變位點。

圖2 TBX5外顯子1測序峰圖(rs780584178)

圖3 TBX5外顯子7測序峰圖(rs201071418)

圖4 TBX5外顯子8測序峰圖(rs200073406)

圖5 TBX5外顯子8測序峰圖(rs149474574)

3.討論

本研究發(fā)現(xiàn)了4例突變，其在NCBI的GeneBank數據庫中注冊的RS號分別為rs780584178、rs201071418、rs200073406和rs149474574。本次發(fā)現(xiàn)的4個SNP位點均未見其與CHD關系的相關報道。研究發(fā)現(xiàn)，至少有2%的CHD是由單基因異常引起的[4]。TBX5是心臟早期發(fā)育中最重要的轉錄因子之一[5]。TBX5屬于T-box轉錄因子家族，位于染色體12q24上，研究證實TBX5是HOS的遺傳易感基因，與遺傳性HOS的發(fā)生發(fā)展密切相關[6]。此外，TBX5突變不僅導致HOS，還導致心臟畸形。研究發(fā)現(xiàn)，TBX5的突變將導致TBX5轉錄因子的異常表達，TBX5轉錄因子的過度表達或表達缺陷將導致心臟發(fā)育畸形[7]。在人類心臟的發(fā)育早期過程中，TBX5主要作為轉錄因子促進和維持心肌細胞成熟，心臟發(fā)育的后期還參與心臟傳導系統(tǒng)的形成[8]。而動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，TBX5在鼠、雞和青蛙中的心臟表達模式與人類非常相似[9]。Diego等[10]對大鼠心臟發(fā)育的研究發(fā)現(xiàn)，TBX5表達不足會造成大鼠房室間隔缺損。因此，全面把握TBX5在心臟發(fā)育中的作用對于理解人類心臟形態(tài)結構和功能具有重要意義。

基因多態(tài)性與疾病的相關性研究是當前的研究熱點，譚等[11]的研究顯示，TBX5的rs1895585、rs78441425、rs55646156位點可能與廈門地區(qū)單純性CHD的發(fā)生有關；黃等[12]的研究顯示，TBX5的rs883079與廣西壯族和漢族兒童CHD的遺傳易感性有關。劉等[13]的研究顯示，rs883079與山東地區(qū)單純性CHD患兒中攜帶突變純合基因型A/A的個體有關(風險增加)；Liu等[14]對北京地區(qū)192例漢族兒童CHD的研究顯示，SNP rs11067075與CHD的發(fā)生密切相關；Wang等[15]研究顯示，基于動物模型的實驗證據證實了心臟發(fā)育對TBX5劑量高度敏感，功能變異體TBX5c.1101C>T(rs6489956)可顯著增加中國漢族CHD患病的風險。而在國外報道中，Behiry等[16]對埃及150例CHD患者的研究顯示，TBX5中的一個變異體(rs6489957)在CHD的發(fā)病機制中起著重要作用。因此，充分了解不同地區(qū)、不同民族TBX5的結構和功能與CHD發(fā)生的關系至關重要。本課題通過對西寧地區(qū)的漢族CHD患者TBX5外顯子測序研究發(fā)現(xiàn)了個別突變位點的存在，可能與CHD有一定的相關性。本次研究只對TBX5外顯子區(qū)域進行了測序分析，故存在一定的局限性，不能全面說明該基因的突變是否導致CHD的發(fā)生。

本課題對人群和種族進行了限定，旨在探討TBX5外顯子區(qū)域突變與西寧地區(qū)漢族人群CHD的相關性。本研究只在核酸分子水平做了檢測，未在蛋白分子水平做進一步研究。本研究結果顯示，TBX5 SNP位點rs201071418的突變位點為非同義突變，編碼的氨基酸由精氨酸突變?yōu)橘嚢彼?，可能會引起相關蛋白的表達異常，最終導致CHD的發(fā)生。盡管在本次研究中SNP位點rs780584178、rs200073406、rs149474574均為非同義突變，但仍可能影響基因轉錄水平以及最終蛋白質的表達。由于本研究發(fā)現(xiàn)的4個SNP位點的突變均未在對照組中出現(xiàn)，因此未做兩組間的等位基因頻率以及基因型頻率的比較。為了更好地研究高海拔地區(qū)乃至高原地區(qū)CHD的發(fā)生機制，仍需做比較研究。因此本課題下一步將從TBX5非編碼區(qū)選擇SNP位點進行基因分型比較，以明確并驗證西寧地區(qū)漢族人群TBX5突變與CHD的發(fā)病機制。

本研究結果顯示，西寧地區(qū)漢族人群CHD可能與TBX5突變存在相關性。