華玉美多，南星梅，楊占婷，蘇姍姍，李占強*，蘆殿香**

[1.青海大學生態(tài)環(huán)境工程學院，青海 西寧 810016；2.青海大學高原醫(yī)學研究中心，高原醫(yī)學教育部重點實驗室，青海省高原醫(yī)學應(yīng)用基礎(chǔ)重點實驗室(青海-猶他高原醫(yī)學聯(lián)合重點實驗室)，青海 西寧 810001；3.青海大學醫(yī)學院，青海 西寧 810001；4.西寧海關(guān)技術(shù)中心，青海省食品安全研究重點實驗室，青海 西寧 810003]

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，唐古紅景天活性部位具有顯著的血管舒張活性，能夠顯著干預低氧性肺動脈高壓的形成；并明確了活性部位的主要化學成分。[1-3]盡管對其作用機制進行了一些研究，但仍不清晰。基于此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學方法構(gòu)建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)，以期揭示唐古紅景天干預肺動脈高壓的具體作用機制，為后續(xù)深入研究提供線索。

1.資料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學相關(guān)數(shù)據(jù)庫及軟件

Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址：http：//new.swisstargetprediction.ch/)[4]；PubChem數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址：https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；Genecard數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址：https：//www.genecards.org/)[5]；UniProt數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址：https：//www.uni prot.org/)；STRING數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址：https：//string-db.org/)；KEGG數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址：http：//www.genome.jp/kegg)。Venny2.1.0軟件；Cytoscape3.6.1軟件。

1.2 實驗方法

1.2.1 化合物的篩選與靶點預測

借助PubChem數(shù)據(jù)庫獲取唐古紅景天活性部位38個主要成分的化學結(jié)構(gòu)(SMILES格式)，并導入Swiss Target Prediction服務(wù)器進行靶點預測，并以靶點相關(guān)概率值≥0.2為標準[6]篩選化合物及相關(guān)靶點。利用Perl語言通過UniProt后臺數(shù)據(jù)庫進行靶點基因注釋。登錄GeneCards網(wǎng)站，以“pulmonary hypertention”“pulmonary arterial hypertention”“hypoxic pulmonary hypertention”為關(guān)鍵詞進行檢索獲得肺動脈高壓疾病相關(guān)靶點，獲取相關(guān)度得分最高的500個靶點，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫進行靶點基因驗證。將獲得的唐古紅景天化學成分預測靶點與肺動脈高壓疾病相關(guān)靶點運用Venny 2.1.0軟件繪制韋恩圖，獲得唐古紅景天干預肺動脈高壓的作用靶點。

1.2.2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建與分析

登錄STRING數(shù)據(jù)庫，選擇“Multiple protenis”項分析，上傳唐古紅景天干預肺動脈高壓的作用靶點，選擇物種為“Homo sapiens”，篩選綜合評分≥0.4的蛋白相互作用參數(shù)，其他參數(shù)為默認參數(shù)，獲得藥物-疾病蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖及TSV文本數(shù)據(jù)。利用R語言對得到的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進行蛋白互作次數(shù)分析。

1.2.3 GO功能和KEGG通路富集分析

借助R語言調(diào)用“org.Hs.eg.db”(人類全基因組注釋)程序包將基因symbol轉(zhuǎn)化為基因ID，再借助R語言調(diào)用bioconductor(http：//www.bioconductor.org/install/)[7]軟件包中的“dose”“clusterProfiler”“pathview”開放源代碼并結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫及Perl語言進行作用靶點的GO功能和KEGG通路富集分析。

1.2.4 “化合物-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

整理化合物-靶點、靶點-通路的相互對應(yīng)關(guān)系，使用Perl對節(jié)點數(shù)據(jù)進行屬性標識，獲得節(jié)點屬性文件。并將所得數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.6.1軟件，進行參數(shù)設(shè)置。得到唐古紅景天活性成分干預肺動脈高壓的“化合物-靶點-通路”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

2.結(jié)果

2.1 唐古紅景天活性成分干預肺動脈高壓的潛在靶點篩選

通過Swiss Target Prediction服務(wù)器利用反向藥效團匹配方法，獲得唐古紅景天活性部位主要化學成分的141個作用靶點(probability value≥0.2)。利用Venny 2.1.0軟件將141個作用靶點與從GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取的前500個肺動脈高壓疾病相關(guān)靶點進行交集篩選，獲得唐古紅景天干預肺動脈高壓潛在作用靶點(圖1)及其化合物與作用靶點信息(表1)。

圖1 唐古紅景天-肺動脈高壓共同靶基因的韋恩圖

表1 唐古紅景天化合物對應(yīng)靶基因信息表

2.2 唐古紅景天活性成分蛋白互作網(wǎng)絡(luò)PPI的構(gòu)建與分析

為進一步分析唐古紅景天干預肺動脈高壓的作用機制，在STRING數(shù)據(jù)庫錄入38個靶蛋白，繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)PPI圖(圖2)。該網(wǎng)絡(luò)中38個靶點都存在相互作用，無游離蛋白，38個節(jié)點相互作用產(chǎn)生了251條蛋白互作邊，平均節(jié)點度數(shù)為13.2。其中互做邊最多的20個靶點如圖3所示，TNF、AKT1、EGFR、PTGS2、SRC、MMP9、MAPK14、ESR1、HRAS等節(jié)點蛋白互作次數(shù)顯著高于其他節(jié)點，提示這些靶蛋白在互作網(wǎng)絡(luò)中比較重要，推測其可能是唐古紅景天干預肺動脈高壓的關(guān)鍵靶點。

圖2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 核心靶蛋白柱狀圖

2.3 GO功能和KEGG通路富集分析

利用Omicshare(https：//www.omicshare.com/tools/index.php/)[8]云平臺對相關(guān)靶點蛋白進行GO功能分析。結(jié)果表明38個相關(guān)靶蛋白共參與了962個GO的生物過程(P<0.01)，涉及到23個BP(Biological Process，BP)相關(guān)條目、8個MF(Molecular Function，MF)相關(guān)條目及15個CC(Cellular Component，CC)相關(guān)條目(圖4)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，這些靶蛋白在BP中主要參與了“對內(nèi)外源性刺激的反應(yīng)”“機體代謝過程”“調(diào)節(jié)生物過程”“細胞過程及信號通路”等相關(guān)二級分類條目。在MF過程中主要參與了“抗氧化活性”“分子功能調(diào)節(jié)”“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性”“離子結(jié)合”“蛋白結(jié)合綁定”“酶催化活性”等主要二級分類條目。在CC過程中這些蛋白主要參與了“細胞器”“細胞內(nèi)膜系統(tǒng)”“膜封閉腔”“細胞連接”“突觸”“囊泡”“胞外基質(zhì)”等二級分類條目。綜合篩選BP+MF+CC三部分中P值最小的前25個GO功能過程進行可視化處理(圖5)。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)前25個功能過程中38個靶點平均富集程度比率達55.65%，最高富集比率達85.7%。

圖4 GO功能二級分類柱狀圖

圖5 GO功能富集分析氣泡圖

通過KEGG通路富集篩選、分析共得到相關(guān)通路192條，對獲得的通路進行數(shù)目統(tǒng)計(圖6)，并進行注釋和靶點數(shù)目統(tǒng)計。發(fā)現(xiàn)192條通路涉及5大類A級通路及其所屬的30類B級通路。主要涉及到免疫、呼吸、神經(jīng)、內(nèi)分泌四大系統(tǒng)；脂質(zhì)、蛋白質(zhì)代謝及與細胞生長、增殖、凋亡相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導通路。對KEGG通路富集分析結(jié)果進一步篩選發(fā)現(xiàn)，P≤0.01的通路有7條，主要涉及C-型凝集素受體信號通路(C-type lectin receptor signaling pathway)、GnRH信號通路(GnRH signaling pathway)、血管內(nèi)皮生長因子信號通路(VEGF signaling pathway)和內(nèi)分泌抵抗信號通路(Endocrine resistance)等。此外還涉及腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、缺氧誘導因子-1信號通路、表皮生長因子受體(ErbB)信號通路、AMPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、JAK-STAT信號通路及與炎癥免疫相關(guān)的花生四烯酸代謝(arachidonic acid metabolism)信號通路等。推測唐古紅景天干預肺動脈高壓的機制可能與干預以上通路過程有關(guān)。其中，根據(jù)相關(guān)度及P值篩選出前29條信號通路(圖7)。

縱坐標黑色字體表示KEGG A級通路，彩色字體表示該A級通路下所屬具體的B級通路，橫坐標表示該通路中富集的基因的數(shù)量

圖7 KEGG富集分析氣泡圖

2.4 “化合物-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape 3.6.1軟件，根據(jù)“化合物-靶點”“靶點-通路”的對應(yīng)關(guān)系，構(gòu)建“化合物-靶點-通路”的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(圖8)。14個黃色節(jié)點表示化合物，38個紅色節(jié)點代表預測蛋白靶點，30個綠色節(jié)點表示相關(guān)通路。結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)關(guān)系既存在一對多，也存在多對一，其中化合物山奈酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)、對香豆酸(p-coumaric acid)、咖啡酸(caffeic acid)、(-)-表兒茶素沒食子酸酯[(-)-epicatechin-3-O-gallate]、紅景天苷(salidroside)等化合物具有明顯的多靶點/多通路的作用特征，初步闡釋了唐古紅景天干預肺動脈高壓的活性物質(zhì)及作用機制。

圖8 化合物-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖

3.討論

紅景天成分復雜，藥理作用廣泛，極具開發(fā)潛力?，F(xiàn)代藥理學研究已表明紅景天具有干預肺動脈高壓的藥理作用，但其發(fā)揮作用的具體機制并不完全清楚。

課題組前期對唐古紅景天干預低氧性肺動脈高壓的活性部位及其抗增殖機制的研究結(jié)果顯示，其活性部位可以抑制慢性低氧引起的肺動脈壓力升高，并通過降低PCNA、細胞周期蛋白D1、細胞周期蛋白CDK4的表達水平抑制p27Kip1降解進而抑制PASMCs的增殖，從而發(fā)揮抑制血管重構(gòu)的作用[1]。

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，并結(jié)合生物信息學對唐古紅景天活性部位主要化學成分干預肺動脈高壓的可能作用機制行深入探討。篩選出有效化學成分14個、干預肺動脈高壓的有效靶點38個。GO功能分析結(jié)果表明，唐古紅景天可能主要通過干擾機體對內(nèi)外源性刺激的反應(yīng)、機體代謝、分子功能調(diào)節(jié)、蛋白結(jié)合綁定、離子結(jié)合及與細胞增殖、遷移、凋亡、程序性死亡相關(guān)的具體功能過程而發(fā)揮保護作用。KEGG通路富集篩選分析結(jié)果顯示，主要涉及“內(nèi)分泌及代謝疾病”“免疫系統(tǒng)”“神經(jīng)系統(tǒng)”“信號轉(zhuǎn)導”“細胞的生長和凋亡”“脂質(zhì)代謝”等六大類相關(guān)通路。

其中Liu J等人的研究發(fā)現(xiàn)IL-33可通過上調(diào)血管內(nèi)皮細胞中的HIF-1α和VEGF表達來啟動低氧性肺動脈高壓的血管重塑[9]；TNF-α在慢性血栓栓塞性肺動脈高壓大鼠血管重構(gòu)中發(fā)揮作用，Liu WY等人的研究發(fā)現(xiàn)通過激活NF-κB/TNF-α途徑可以保護大鼠肺動脈高壓[10]；越來越多的實驗數(shù)據(jù)表明AMPK聯(lián)級信號通路在血管動態(tài)平衡中起著至關(guān)重要的作用，Wang HL等人最新的研究表明AMPKα2敲低可促進缺氧條件下肺動脈平滑肌細胞(PASMC)的增殖，這種現(xiàn)象伴有Skp2上調(diào)和p27kip1表達下調(diào)，并能夠被雷帕霉素(mTOR抑制劑)調(diào)控，即增強對AMPKα2活性的控制可能是肺動脈高壓的新治療策略基礎(chǔ)[11]。此外KEGG分析結(jié)果中所顯示的PI3K-Akt、JAK-STAT、IL-17、FoxO、Ras等多條信號通路均已證實與肺動脈高壓的形成、發(fā)展及治療有關(guān)[12-16]。

目前已被研究證實具有干預肺動脈高壓作用的紅景天化學成分有紅景天苷、槲皮素、異槲皮苷、蘆丁、兒茶素等[17-26]。研究發(fā)現(xiàn)紅景天苷能夠通過AMPKα1-P53-P27/ P21途徑抑制慢性缺氧誘導的PASMCs增殖，并通過AMPKα1-P53-Bax/ Bcl-2-caspase 9-caspase 3途徑逆轉(zhuǎn)凋亡抗性[19]；可通過AKT /GSK3β信號通路抑制血小板源性生長因子BB(PDGF-BB)誘導的PASMCs增殖[20]；可通過上調(diào)AMPK-mTOR-ULK1途徑的自噬而減輕缺氧誘導的肺動脈平滑肌細胞增殖和凋亡抗性以及通過影響HIF- 1α進而對肺血管收縮及重建起作用[21-22]。槲皮素能夠呈劑量依賴性方式抑制缺氧低氧下TrkA/AKT信號級聯(lián)的激活，并能單獨抑制TrkA/AKT信號傳導途徑，進而減少PASMCs遷移，阻滯細胞周期并誘導凋亡[23]；還能夠通過Akt和Erk1/2途徑抑制肺動脈內(nèi)皮細胞(PAEC)轉(zhuǎn)分化從而有效治療肺動脈高壓[24]；槲皮素還可通過FOXO1-SENS3-mTOR信號通路增強缺氧誘導的PASMCs自噬[25]。異槲皮苷可抑制PDGF-BB誘導的PASMCs增殖，下調(diào)細胞周期蛋白D1和CDK4的表達，并抑制p27Kip1的降解，并對PDGF-BB誘導的PDGF-β、Akt/GSK3β和ERK1/2磷酸化產(chǎn)生負調(diào)節(jié)作用，引起G0/G1期細胞周期停滯[26]。根據(jù)“化合物-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)可知，唐古紅景天活性部位中槲皮素、山奈酚、對香豆酸、咖啡酸、紅景天苷等化合物作用靶點及通路較多，存在單組分-多靶點、多組分-單靶點的特點，部分機制已被相關(guān)研究所證實，為深入闡明唐古紅景天干預肺動脈高壓的多組分-多靶點機制，以及開展各活性成分間相互作用(協(xié)同、疊加、拮抗)研究提供了思路。