李 星，張志剛，林慧卿，葉 斌，方丹楓

(浙江省臺州市中心醫(yī)院/臺州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院小兒內(nèi)科，浙江 臺州 318000)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染是臨床上較為常見的感染性疾病，且在兒童中具有較高的發(fā)病率和致殘率。據(jù)2010年世界衛(wèi)生組織(world health organization，WHO)流行病學(xué)調(diào)查顯示，全球兒童腦膜炎發(fā)病率約為10.5～13.8/100 000，病死率為30%，1/3的幸存患兒遺留有不同程度殘疾[1-2]。由于目前廣譜抗生素的濫用和病原體耐藥性的增加，中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染不典型的問題日益增多[3]。加之患兒在發(fā)病初期臨床表現(xiàn)尚不典型，僅靠傳統(tǒng)血液及腦脊液常規(guī)檢查常難以鑒別。因此，探尋簡單、高效的實驗室指標(biāo)指導(dǎo)臨床工作，進而達到早期快速診斷、及時針對治療，對降低患兒并發(fā)癥和致死率、改善預(yù)后具有重要的意義，也是目前小兒神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)生的研究熱點。

近年來多項研究表明，血清學(xué)相關(guān)炎性因子在小兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染發(fā)生發(fā)展中起著重要的干預(yù)作用，發(fā)病早期患兒血清和腦脊液多種炎性因子如降鈣素原(procalcitonin，PCT)、C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶等指標(biāo)即可出現(xiàn)異常高表達[4]。Morales[5]和Henry等[6]研究發(fā)現(xiàn)，PCT在鑒別細(xì)菌性與病毒性顱內(nèi)感染具有較高的敏感度和準(zhǔn)確度，其異常表達升高可作為抗生素使用的依據(jù)。但Hoshina等[7]發(fā)現(xiàn)PCT并非在所有細(xì)菌性腦膜炎患者中均存在異常升高，其在局灶型中樞系統(tǒng)感染如腦膿腫、硬膜下積膿等中并無診斷作用，因此僅將其單獨作為篩查指標(biāo)仍存在不足。故有學(xué)者提出對早期腦膜炎患者采取多指標(biāo)聯(lián)合檢測的篩查方法。Mariscalco[8]和陳若虹[9]等研究發(fā)現(xiàn)血液及腦脊液肝素結(jié)合蛋白(heparin-binding protein，HBP)水平在診斷細(xì)菌性感染、評估感染嚴(yán)重程度和預(yù)后方面具有重要的價值。但上述研究均未對患者年齡進行分層比較，研究對象多為成人或大齡兒童患者?；谝陨媳尘?，本研究擬對2016年9月至2018年1月在我院兒科病房收治的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患兒進行血漿和腦脊液HBP、PCT檢測，探討二者單獨及聯(lián)合檢測對小兒顱內(nèi)感染的臨床診斷價值，以期為顱內(nèi)感染患兒的早期診斷、及時治療提供更多的參考指標(biāo)。

1資料與方法

1.1研究對象

選取2016年9月至2018年1月在浙江省臺州市中心醫(yī)院兒科病房收治的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患兒為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①納入患兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染包括化膿性腦(膜)炎(簡稱化腦組)、結(jié)核性腦(膜)炎(簡稱結(jié)腦組)和病毒性腦(膜)炎(簡稱病腦組)診斷明確，癥狀、體征及腦脊液檢查均符合江載芳等[10]主編第8版《諸福棠實用兒科學(xué)》診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡1歲～13歲；③初次入院，住院時間≥48h；④自愿配合治療及后續(xù)動態(tài)隨訪且病例資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①排除入院時Glasgow昏迷評分<8分患兒；②合并有其他部位感染、嚴(yán)重肝腎功能疾病、腫瘤、凝血功能障礙者；③合并有代謝性疾病或自身免疫病者；④排除入院前已使用抗生素治療患兒。共納入符合上述標(biāo)準(zhǔn)患兒97例，其中化腦組患兒39例，男23例，女16例；年齡1歲～11歲，平均(4.8±3.2)歲；病腦組患兒35例，男21例，女14例；年齡1.6歲～12歲，平均(4.4±3.6)歲；結(jié)腦組患兒23例，男14例，女9例；年齡3歲～13歲，平均(4.9±3.1)歲。同期隨機選取我院30例非感染性無熱驚厥患兒作為正常對照組，男18例，女12例；年齡2歲～12歲，平均(5.1±4.2)歲。行三大常規(guī)、血清生化檢查、腦脊液檢查及影像學(xué)檢查均排除神經(jīng)系統(tǒng)感染及其他系統(tǒng)炎癥。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析四組受試者年齡、性別比較無明顯差異(F=17.044和22.541，P>0.05)。本研究數(shù)據(jù)由醫(yī)院病例管理中心提供，并由專業(yè)數(shù)據(jù)處理人員進行校驗。研究方案符合我院倫理委員會要求，所有受試者及家屬均獲得了解研究目的并簽訂知情同意書，并享受隨時退出權(quán)力。

1.2方法

①美國BECKMAN公司生產(chǎn)的DXI800電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀；②美國Bio Tek公司生產(chǎn)的Synergy H1全功能酶標(biāo)儀；③HBP配套試劑盒及質(zhì)控品由BECKMAN公司提供；④PCT配套試劑盒及質(zhì)控品則由江蘇晶美公司提供。

所有受試者均在入院后24 h內(nèi)空腹?fàn)顟B(tài)下(>2h)采集靜脈血4mL，常溫下靜置30min，然后以1 500×g(2 500rpm)下離心15min，分離血漿后置于-70℃超低溫冰箱內(nèi)保存。同時在患兒入院后行腰椎穿刺采集腦脊液2mL，將腦脊液以200×g(3 000rpm)下離心5min后-70℃冰箱內(nèi)保存待用。

受試者PCT水平檢測采取電化學(xué)發(fā)光免疫分析法，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。血漿HBP水平測定采取雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，將分離血漿從冷藏冰箱中取出后常溫解凍，按照HBP試劑盒相關(guān)參考說明對試劑標(biāo)準(zhǔn)品進行濃度稀釋，每小孔內(nèi)滴定100μL，在37℃恒溫箱中孵育1.5h，每小孔內(nèi)滴定酶結(jié)合物100μL(空白孔除外)，再次在37℃下孵育0.5h，然后每小孔滴定底物顯色試劑100μL，37℃下孵育15min(注意避光處理)，最后每小孔滴定終止液100μL，充分搖勻后立即測定其在波長450nm下的吸光度值(A450值)，按照標(biāo)準(zhǔn)品濃度和A450值設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，測出標(biāo)準(zhǔn)品A450值下對應(yīng)的HBP含量。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

采用雙人雙錄入法將所得數(shù)據(jù)錄入Epidata 3.0軟件建立中樞系統(tǒng)感染患兒數(shù)據(jù)庫。采用SPSS 19.0版統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。經(jīng)單樣本K-S檢驗，三組患者血漿及腦脊液HBP、PCT水平均為非正態(tài)分布，采用中位數(shù)(第25百分位數(shù)，第75百分位數(shù))[M(P25，P75)]表示，多組間比較采取Kruskal-Wallis H秩和檢驗，組間兩兩比較用Nemenyi檢驗；相關(guān)性分析采用秩相關(guān)分析法；患兒血漿及腦脊液HBP、PCT水平對化膿性腦膜炎的診斷效能比較采用受試者工作特征(receiver operator characteristic，ROC)曲線，曲線下面積(area under curve，AUC)比較采用手工Z檢驗；靈敏度、特異度和準(zhǔn)確度比較采用χ2檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組患兒血漿和腦脊液HBP、PCT水平比較

化腦組患兒血漿和腦脊液HBP、PCT水平均明顯高于病腦組、結(jié)腦組和對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；病腦組和結(jié)腦組血漿和腦脊液HBP水平均明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而病腦組血漿和腦脊液PCT水平與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組患兒血漿和腦脊液HBP、PCT水平比較 [M(P25，P75)]

注：與病腦組、結(jié)腦組和對照組比較，aP<0.05；與對照組比較，bP<0.05；與對照組比較，cP>0.05。

2.2各組患兒血漿、腦脊液HBP、PCT水平的相關(guān)性

秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，化腦組患兒血漿HBP和PCT水平呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.544，P<0.01)，腦脊液HBP和PCT水平也呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.627，P<0.01)。病腦組血漿PCT水平接近正常，患兒血漿和腦脊液HBP和PCT水平均無明顯相關(guān)性(r值分別為0.127、0.204，P>0.05)。結(jié)腦組患兒血漿HBP和PCT水平呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.461，P<0.01)，腦脊液HBP和PCT水平也呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.552，P<0.01)。

2.3血漿HBP和PCT單項及聯(lián)合檢測對化膿性腦膜炎患兒的診斷價值

以病腦組、結(jié)腦組和對照組為對照，繪制血漿HBP和PCT單項及聯(lián)合檢測診斷化膿性腦膜炎的ROC曲線，單項檢測時，HBP和PCT的ACU分別為0.866(95%CI：0.779～0.952)和0.777(95%CI：0.667～0.888)，而二者聯(lián)合檢測時AUC面積最大，為0.943(95%CI：0.893～0.994)，經(jīng)手工Z檢驗比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。選取上述三種指標(biāo)ROC曲線約登指數(shù)最大值所對應(yīng)值為cut-off值，HBP和PCT分別為27.76 ng/mL和0.23 ng/mL。當(dāng)上述指標(biāo)取cut-off值時，聯(lián)合檢測時的準(zhǔn)確度均較單項檢測明顯提高，靈敏度和特異度均高于PCT單項檢測，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖1和表2。

圖1 血漿HBP和PCT診斷化膿性腦膜炎的ROC曲線

表2 血漿HBP和PCT對化膿性腦膜炎患兒的診斷效能

注：組間比較檢驗水準(zhǔn)α=0.017，a與聯(lián)合檢測比較，P<0.05。

2.4 腦脊液HBP和PCT單項及聯(lián)合檢測對化膿性腦膜炎患兒的診斷價值

同樣方法繪制腦脊液HBP和PCT單項及聯(lián)合檢測診斷化膿性腦膜炎的ROC曲線，單項檢測時，HBP和PCT的ACU分別為0.907(95%CI:0.838～0.976)和0.810(95%CI：0.708～0.911)，而二者聯(lián)合檢測時AUC面積最大，為0.952(95%CI:0.902～0.972)，經(jīng)手工Z檢驗比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。選取上述三種指標(biāo)ROC曲線約登指數(shù)最大值所對應(yīng)值為cut-off值，當(dāng)HBP含量取21.07ng/mL或PCT取0.12ng/mL為診斷化膿性腦膜炎的截斷點時，其特異度、準(zhǔn)確度均低于聯(lián)合檢測，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2和表3。

圖2 腦脊液HBP和PCT診斷化膿性腦膜炎的ROC曲線

表3 腦脊液HBP和PCT對化膿性腦膜炎患兒的診斷效能

注：組間比較檢驗水準(zhǔn)α=0.017，a與聯(lián)合檢測比較，P<0.01。

3討論

3.1肝素結(jié)合蛋白與患兒顱內(nèi)感染

HBP又稱天青殺素或CAP37，最先是由王亮等[11]在激活的中性粒細(xì)中分離獲得的一種多功能蛋白，是胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶家族中的一員，因其具有極強肝素結(jié)合能力而得名。既往研究證實，HBP具有趨化細(xì)胞因子、致炎、抗凋亡、提高血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性等多種炎性介質(zhì)功能，是構(gòu)成人體非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分[12]。Linder等[13]研究發(fā)現(xiàn)，HBP在通常情況處于低表達狀態(tài)，故健康成人中HBP水平一般不超過10ng/mL，僅在中性粒細(xì)胞受到菌體本身或者細(xì)菌釋放的毒素激活后，患者血漿HBP水平呈現(xiàn)爆發(fā)式增長，甚至可超過100ng/mL。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化腦組患兒血漿和腦脊液HBP水平均明顯高于病腦組、結(jié)腦組和對照組；病腦組和結(jié)腦組血漿和腦脊液HBP水平均明顯高于對照組。這與Kandil等[14]研究結(jié)果相似，該研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌性腦膜炎患者HBP水平明顯高于病毒性腦膜炎組和正常對照組，當(dāng)患者腦脊液和血漿中的HBP最佳截斷點為56.7ng/mL和45.3ng/mL，細(xì)菌性腦膜炎總體準(zhǔn)確度可達100%。表明血漿或腦脊液HBP水平在腦膜炎尤其是細(xì)菌性腦膜炎患兒的診斷具有重要的臨床價值，其升高程度可能成為鑒別患兒腦膜炎類型尤其是細(xì)菌性和病毒性顱內(nèi)感染的有效指標(biāo)。故筆者建議對于臨床上伴有明顯中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染癥狀且血漿HBP濃度明顯升高的患兒，可進一步行有創(chuàng)性腦脊液檢查明確診斷，以降低對腦膜炎患兒的漏診率和延誤治療時間。

此外，本研究以病腦組、結(jié)腦組和對照組為對照，進一步繪制血漿或腦脊液HBP檢測在診斷化膿性腦膜炎的ROC曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血漿和腦脊液AUC分別為0.943和0.907，而腦脊液cut-off值為21.07ng/mL時，敏感度、特異度和準(zhǔn)確度分別為84.61%、84.09%和84.25%。另有學(xué)者研究結(jié)果顯示，腦脊液HBP在診斷細(xì)菌性腦膜炎AUC可達到0.994，且當(dāng)最佳截斷點取20 ng/mL時，檢驗效能中敏感度、特異度可達到100%和99.2%[15]。本研究結(jié)果與上述究結(jié)果有所差異，分析原因可能如下：①本研究納入對象為13歲以下患兒，且已排除入院時Glasgow昏迷評分<8分患兒，納入人群年齡階段更為集中，更具有代表性；②本研究部分對象入院前已自行或在外院接受過部分治療(抗生素除外)，可能對檢測結(jié)果造成影響；③由于患兒血液及腦脊液HBP濃度存在時間依賴型，且與病情嚴(yán)重程度相關(guān)，故不同標(biāo)本采集時間也會對實驗結(jié)果造成一定誤差[6,16]。

3.2降鈣素原與患兒顱內(nèi)感染

PCT是由116個氨基酸組成的降鈣素前肽物質(zhì)，正常生理條件下，機體僅有甲狀腺C細(xì)胞分泌微量PCT，故健康成人血清PCT處于低水平狀態(tài)，一般不超過0.05ng/mL[5]。而在細(xì)菌感染狀態(tài)下，PCT可在細(xì)菌毒素和炎性細(xì)胞因子刺激下大量產(chǎn)生，感染后2 h內(nèi)即可在血清中測出，達峰時間在12～24 h。另有研究發(fā)現(xiàn)，對于病毒性感染患者，即便處于病毒感染急性期，多數(shù)患者PCT水平仍處正常水平或輕微升高狀態(tài)[17]。故目前PCT已廣泛用于細(xì)菌性感染和病毒感染鑒別診斷、預(yù)后評價和療效觀察中。一項納入了8項研究共616名患兒的大型Meta分析研究發(fā)現(xiàn)，血清PCT測定對區(qū)分患兒腦膜炎病因具有較高的準(zhǔn)確性，其靈敏度和特異度匯總值分別為0.96和0.89，是快速區(qū)分細(xì)菌和病毒性腦膜炎患兒的有效指標(biāo)[18]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，化腦組血漿和腦脊液PCT水平明顯高于病腦組，而病腦組血漿和腦脊液PCT水平與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。任磊等[19]也發(fā)現(xiàn)PCT在小兒細(xì)菌性腦膜炎與病毒性腦膜炎的鑒別診斷具有較高的價值，其敏感性及特異性均優(yōu)于血沉診斷。上述研究均表明血漿和腦脊液PCT水平均可對中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患兒的感染病因進行初步篩查，有望成為細(xì)菌性腦膜炎患兒鑒別診斷的有效輔助指標(biāo)。此外，本研究中有4例病毒性腦膜炎患兒血漿PCT水平高于正常范圍，這與既往認(rèn)為病毒性腦膜炎患兒PCT水平無明顯變化存在差異，筆者分析原因認(rèn)為可能與病毒性腦膜炎患兒合并有多臟器功能損傷有關(guān)。

3.3 HBP和PCT在患兒顱內(nèi)感染的聯(lián)合診斷價值

既往多項研究認(rèn)為血漿HBP和PCT水平在膿毒癥患者中存在相關(guān)性，二者聯(lián)合檢測有助于對膿毒癥患者診斷和病情進展評估[20-21]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，化腦組和結(jié)腦組血漿、腦脊液HBP和PCT水平均存在異常升高。秩相關(guān)性分析結(jié)果也證實了化腦組和結(jié)腦組患兒血漿、腦脊液HBP和PCT水平均呈正相關(guān)關(guān)系。這提示HBP和PCT可能在細(xì)菌性腦膜炎的發(fā)生發(fā)展中存在交互作用，但需進一步研究控制其余炎性指標(biāo)過表達是否會對各指標(biāo)產(chǎn)生影響，如Liu等[22]發(fā)現(xiàn)在膿毒癥患者血清中除了HBP和PCT外，血管生成素-2也存在mRNA水平增加。此外，值得注意的是，病腦組血漿和腦脊液PCT水平與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。該組患兒血漿和腦脊液HBP、PCT水平均無明顯相關(guān)性。這提示單采取PCT檢測對于病毒性腦膜炎具有局限性，應(yīng)結(jié)合其他指標(biāo)來進一步驗證病毒性腦膜炎的診斷。但目前可以證實的是HBP和PCT間存在信號通路的相互調(diào)節(jié)和聯(lián)系，這就為臨床上聯(lián)合檢測診斷提供了理論依據(jù)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在血漿中二者聯(lián)合檢測診斷化膿性腦膜炎時，AUC面積最大，為0.952，準(zhǔn)確度可達到90.55%。腦脊液中二者聯(lián)合檢測AUC面積最大可達0.952，準(zhǔn)確度為96.85%，均明顯高于單項檢測準(zhǔn)確度。上述結(jié)果表明不論是在血漿還是腦脊液中，二者聯(lián)合檢測均能顯著提高細(xì)菌性腦膜炎患兒檢出率，具有較高的診斷效能，且腦脊液中兩種指標(biāo)聯(lián)合檢測更具有優(yōu)勢。但由于目前尚缺乏臨床大樣本量支持，因此該研究仍存在較大的拓展空間。

綜上所述，HBP、PCT在化膿性腦膜炎患兒血漿和腦脊液中均呈高表達狀態(tài)，其表達水平與病原體類型明顯相關(guān)，是鑒別小兒中樞系統(tǒng)感染類型的有效指標(biāo)。且在血漿與腦脊液中聯(lián)合檢測均可提高化膿性腦膜炎患兒的檢出率和準(zhǔn)確度，有利于早期診斷和及時判斷顱內(nèi)感染病情。此外，由于受技術(shù)及設(shè)備的限制，本研究仍存在不足之處。主要是納入患兒例數(shù)較少，且未研究其他腦膜炎類型如真菌性腦膜炎等血漿及腦脊液上述指標(biāo)變化情況。本研究后續(xù)將進一步納入更多腦膜炎患兒及將病原體細(xì)化分組，并采取前瞻性研究系統(tǒng)分析二者聯(lián)合在不同致病類型腦膜炎患兒的診斷價值。