廖鴻力，林 鵬，葉 瓊

(1.溫州市中心醫(yī)院病理科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科，浙江 溫州 325000)

子宮內(nèi)膜癌為子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤，近年來發(fā)病率逐年升高，對女性的身心健康產(chǎn)生了嚴重影響[1]。已有研究指出無孕激素抵抗的雌激素長期刺激可誘發(fā)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生，但臨床中尚未明確其發(fā)病機制，也有研究表面子宮內(nèi)膜癌是原癌基因激活、抑癌基因失活、細胞信號傳導異常所致[2]。多數(shù)狀態(tài)下，癌癥是由異常全基因組的低甲基化和局部CpG島高甲基化所致，幾乎所有哺乳動物中的DNA甲基化均發(fā)生在CpG島內(nèi)，該區(qū)域的甲基化與基因的轉錄抑制相關。臨床中抑制對某些抑癌基因和致癌基因的表達進行調(diào)控可影響細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等。研究發(fā)現(xiàn)miRNA在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中均存在異常表達，miR-129-2低表達為常預示結腸癌患者的不良預后且在HER-2陽性的胃癌和乳腺癌患者體內(nèi)miR-129表達也出現(xiàn)下調(diào)[3]。SOX4基因定位于人類染色體6p.23上，可編碼一種分子量47kD含474個氨基酸的蛋白，位于N端的HMG結構域和C端的TAD結構域是SOX4發(fā)揮功能的主要區(qū)域。SOX基因的異常改變與多種腫瘤的發(fā)生和惡性生物學行為息息相關[4]。已有研究顯示，在多種實體腫瘤中有SOX4基因的過量表達，并與患者的不良預后有關[5]。為探索子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展和轉移分子機制，確立防治靶點，尋求新的治療策略，本研究以期通過實驗探討miR-129-2靶向調(diào)節(jié)SOX4表達對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖和凋亡的影響。

1資料與方法

1.1一般資料

子宮內(nèi)膜癌細胞株Ishikawa由中科院上海細胞生物學研究所細胞庫購入。購入60只雄性SPF級裸鼠，2月齡，體質(zhì)量為18～22g，平均(20.02±1.28)g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心購入，合格證編號為：SYXK(桂)2019-1001，本研究遵循《實驗動物保護條例》。

人體組織標本由本院病理實驗室提供，來自本院近年接診的婦女患者術前診斷和術中病理所采集樣本，包括66例子宮內(nèi)膜癌組織，42例正常子宮內(nèi)膜組織。

1.2材料

TES裂解緩沖液：100mM NaCL，25mM EDTA(pH=8.0)，10mM Tris-HCl(pH=8.0)，1%SDS；RNaseA(10mg/mL)終濃度為0.05mg/mL；蛋白酶K(20mg/mL)終濃度為0.1mg/mL；氯仿；Tris-飽和酚；無水乙醇；乙酸鈉溶液(3M，pH=5.0)；1mM EDTA(pH=8.0)；TE溶液：10mM Tris-HCl(pH=8.0)。

PCR 2x HotStar Taq MasterMix；限制性內(nèi)切酶；瓊脂糖；高保真性PCR擴增試劑盒；DNA marker；TAE電泳緩沖液：100mmol/L EDTA，2mol/L Tris堿，1mol/L冰乙酸；PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒。

DMEM低糖細胞培養(yǎng)基；LipofectamineTM2000轉染試劑盒；質(zhì)粒提取試劑盒；MTT；SOX4多克隆抗體；嘌呤霉素；鏈霉素和青霉素；載體miRNASelectTMpEGP-miR。

1.3細胞培養(yǎng)和轉染

使用含10%胎牛血清、100μg/mL鏈霉素和100U/mL青霉素DMEM低糖細胞培養(yǎng)基于37℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)行常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的Ishikawa細胞，以0.25%胰蛋白酶消化后支撐細胞懸液，接種在96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每組4個平行孔，每孔細胞密度為5 000個。在培養(yǎng)箱內(nèi)過夜，若細胞融合度達到70%，按照LipofectamineTM2000說明書步驟進行轉染。轉染后6h更換含有血清的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h以便進行后續(xù)實驗。同時設立空白對照組。

1.4 DNA提取

①取100mg液氮內(nèi)凍存的組織，置于液氮研缽內(nèi)，并裝入2mL鋼珠離心管內(nèi)，震蕩至粉末狀；②加180μL ALT裂解緩沖液，20μL蛋白酶K溶液，混勻置于37℃水浴消化過夜；③依據(jù)試劑盒提取DNA，-20℃保存待測。

使用6cm培養(yǎng)基培養(yǎng)，回合率為90%時收取細胞沉淀，按照試劑盒抽提法提取細胞系基因組DNA。

1.5甲基化檢測

①建立酶切反應預混合液；②混合液混合后取等量于200μL PCR反應管內(nèi)建立酶切反應；③將反應管置于普通PCR反應儀內(nèi)，37℃下4～6h，95℃下10min，處理后樣本置于—20℃下保存待測；④在基因CpG島區(qū)域內(nèi)設計引物，所擴增DNA片段含有兩個HhaI酶切位點，并確保酶切效率。

1.6 MTT檢測

上述轉染后的細胞在終止前4h每孔內(nèi)加入5g/L MTT溶液20μL內(nèi)，孵育4h后棄上清液，加150μL二甲基亞砜后振蕩10min，結晶物完全溶解后，在熒光酶聯(lián)分析儀上測光吸收值，使用490nm波長，重復三次。

1.7 Western Blot檢測

收集細胞用蛋白裂解液，處理并取上清液，取各組蛋白30μL于8%SDS-PAGE電泳電轉移至PVDF膜上，使用脫脂奶粉封閉1h，覆上1∶100的SOX4兔單抗過夜，使用TBST洗滌3次，10min/次。加入1∶200的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗，37℃下孵育1h，洗膜后使用含有化學發(fā)光劑的水溶液激發(fā)熒光，暗室內(nèi)壓片，顯影，定影，分析圖像。

1.8建立裸鼠模型

將對數(shù)生長期的各組細胞經(jīng)胰酶消化、離心、收集、計數(shù)，制備5×107個/mL細胞懸液注入裸鼠腋窩中部背側皮下，腋下接種0.2mL/只，1周后出現(xiàn)腫瘤，每3d測量一次裸鼠的體重和瘤體大小，計算腫瘤體積。30d后處死裸鼠取瘤組織稱重，計算抑瘤率。抑瘤率=(1-處理組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100%。

1.9統(tǒng)計學方法

2結果

2.1 miR-129-2在子宮內(nèi)膜細胞中的甲基化狀態(tài)

Ishikawa細胞系中miR-129-2啟動子區(qū)甲基化強度為74.47%。本研究中所選取的66例子宮內(nèi)膜癌組織中38例存在miR-129-2啟動子區(qū)高甲基化(占57.58%)，且癌旁組織內(nèi)無甲基化。Western Blot檢測結果顯示，空白對照組、陰性對照組、轉染高表達組的子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞中SOX4蛋白表達量分別為0.43±0.01、0.34±0.03、0.10±0.04，高表達組的SOX4蛋白表達量顯著低于陰性對照組和空白對照組(t值分別為2.436、3.786，均P<0.05)，陰性對照組則顯著低于空白對照組(t=2.897，P<0.05)，各組SOX4蛋白表達見圖1。

圖1各組SOX4蛋白表達

Figure 1 SOX4 protein expression in each group

2.2 miR-129-2在子宮內(nèi)膜癌及正常子宮內(nèi)膜組織樣本中的表達

將β-actin作為內(nèi)參基因，將miR-129-2與各組的β-actin差值作為樣本中目的基因的mRNA表達水平，比較66例子宮內(nèi)膜癌組織和42例正常子宮內(nèi)膜組織的miR-129-2表達，結果顯示其在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達為0.001±0.001，顯著低于正常子宮內(nèi)膜組織的0.003±0.002(t=6.020，P=0.000)。

2.3各組Ishikawa細胞不同時間增殖活性比較

3組Ishikawa細胞培養(yǎng)24h、48h、72h、96h和120h細胞增殖能力比較均有顯著性差異(均P<0.05)，其中miR-129-2高表達組細胞增殖能力最低。進一步每兩組之間比較顯示miR-129-2高表達組在48h、72h、96h、120h時間點細胞增殖能力均顯著低于陰性對照組和空白對照組(t值為2.356～10.987，均P<0.05)，而陰性對照組和空白對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(t值為0.980～1.235，均P>0.05)，見表1。

2.4 miR-129-2對裸鼠體質(zhì)量及移植瘤重量的影響

3組裸鼠瘤體濕重、終體積、腫瘤相對體積比較均有顯著性差異(均P<0.05)，其中miR-129-2上述指標最低。進一步每兩組之間比較顯示miR-129-2高表達組瘤體濕重、終體積、腫瘤相對體積均顯著低于陰性對照組和空白對照組(t值為3.124～19.446，均P<0.05)，而陰性對照組和空白對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(t值為0.884～1.459，均P>0.05)，見表2。

表1 各組Ishikawa細胞不同時間增殖活性比較

表2 miR-129-2對裸鼠體質(zhì)量及移植瘤重的影響

2.5miR-129-2對子宮內(nèi)膜癌的診斷價值分析

進一步探討miR-129-2對子宮內(nèi)膜癌預測診斷價值，以子宮內(nèi)膜癌組織為陽性樣本(n=66)，以正常子宮內(nèi)膜組織為陰性樣本(n=42)，建立ROC診斷分析模型。將miR-129-2的表達量分成7-10個組段。結果顯示該指標對子宮內(nèi)膜癌具有較高的診斷價值，ROC-AUC為0.768。理論閾值點為0.002，對應的敏感度和特異度分別為0.772、0.745，見圖2。

圖2 miR-129-2對子宮內(nèi)膜癌的診斷價值ROC曲線

3討論

3.1 miR-129與子宮內(nèi)膜癌的關系

近年來我國子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生率逐年增長，抑癌基因和癌基因異常變化均是促進腫瘤進展的重要機制之一[6]。子宮內(nèi)膜癌的分期與臨床治療和預后均有密切相關性，中晚期或轉移子宮內(nèi)膜癌患者5年內(nèi)生存率不足30%[7]。盡管臨床中的經(jīng)陰道超聲檢查、經(jīng)腹超聲檢查、MRI、CT對子宮內(nèi)膜癌具有較佳的診斷性和敏感性，但結構和形式的變化常滯于腫瘤功能障礙后。因此尋找與腫瘤生物學行為相近，且敏感性和特異性較高的分子標志物，是提高子宮內(nèi)膜癌早期診斷和臨床預后的重要途徑[8]。

miR-129與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切相關性，可通過調(diào)控細胞增殖、侵襲、遷移、免疫系統(tǒng)和腫瘤耐藥等途徑參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程。有研究指出食管鱗狀細胞癌中miR-129表達下調(diào)，可下調(diào)周期相關蛋白進而抑制癌細胞增殖、侵襲和遷移[9]。考慮SOX4基因主要在胚胎發(fā)育過程中表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟和胸腺，可穩(wěn)定干細胞，因此其突變、缺失、過量表達等均可能導致先天性疾病的發(fā)生，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。已有研究證實多種實體腫瘤中均存在SOX4基因過量表達，且常預示不良預后[10]。本研究由miR-129-2靶向調(diào)節(jié)SOX4表達入手進行研究，觀察其對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖和凋亡的影響，以期能為后期臨床診斷、治療提供參考。

通過通量甲基化檢測技術的不斷發(fā)展，人們加深了對腫瘤發(fā)生前后各階段整體基因組甲基化模式變化的認識。miR-129-2為miRNA家族之一，其異常表達與細胞周期的阻滯、侵襲、轉移、凋亡和衰老相關。已有計算機預測miR-129-2的下游基因為SOX4，其為某種原癌基因，在Wnt通路中有重要作用[11]。不同類型的腫瘤組織中miR-129-2均呈現(xiàn)低表達，包括胃癌、結腸癌、食管鱗癌、膀胱癌等，但目前臨床中尚未明確miR-129-2在子宮內(nèi)膜癌中的作用機制[12]。本研究結果顯示，Ishikawa細胞系中miR-129-2啟動子區(qū)甲基化強度為74.47%。本研究中所選取的66例子宮內(nèi)膜癌組織中38例存在miR-129-2啟動子區(qū)高甲基化(占57.58%)，且癌旁組織內(nèi)無甲基化。高表達組的Ishikawa細胞中SOX4蛋白表達量顯著低于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)，陰性對照組則顯著低于空白對照組(P<0.05)。miR-129-2在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達顯著低于正常子宮內(nèi)膜組織(P=0.000)。

3.2miR-129在預測子宮內(nèi)膜癌中的價值

鑒于DNA甲基化為潛在的可逆表現(xiàn)遺傳變化，因此臨床中可考慮給予患者脫甲基作用抑制劑進行抗癌治療。目前已有研究指出SOX4基因在肝癌患者體內(nèi)組織中過度表達，且與術后早期高危復發(fā)有密切相關性，但其表達水平與患者的年齡、性別、腫瘤直徑、Edmonson分級、乙肝表面抗原等無關，其高表達可作為臨床判斷肝癌預后的指標之一[13]。Andersend等于2009年報道，SOX4高表達的結直腸癌腫瘤患者具有較高的復發(fā)率，總生存率較低。以上實驗提示SOX4可作為癌基因參與腫瘤的侵襲、轉移和復發(fā)。本研究中子宮內(nèi)膜癌組織中miR-129-2的表達均低于癌旁組織，且miR-129-2能夠降低子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞的增殖能力，并隨著培養(yǎng)時間的延長抑制作用增強。β-actin與轉錄因子結合啟動Wnt信號通路，miR-120-2高表達組大鼠體內(nèi)SOX4的DNA結合部位與轉錄因子的DNA結合部位相似度較高，Wnt信號通路激活，進而抑制了子宮內(nèi)膜癌細胞毒增殖能力[14]。沉默SOX4基因表達后可降低腫瘤細胞中核轉錄因子kB的表達，同時P53蛋白穩(wěn)定性增強，凋亡抑制因子Survivin表達丟失，腫瘤凋亡增加。本研究中高表達miR-129-2組的裸鼠瘤體濕重、終體積和腫瘤相對體積均低于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)，提示miR-129-2可抑制子宮內(nèi)膜的發(fā)生和發(fā)展。此外，本研究進一步分析的miR-129-2對子宮內(nèi)膜癌的預測價值，結果顯示其對子宮內(nèi)膜癌具有較高的診斷價值，AUC為0.768，理論閾值點為0.002，對應的敏感度和特異度分別為0.772，0.745。

綜上所述，miR-129-2在子宮內(nèi)膜癌組織和細胞系內(nèi)均存在明顯甲基化，因基因啟動子區(qū)miR-129-2在子宮內(nèi)膜癌組織中表達降低，miR-129-2可抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞的增殖，促進凋亡，其作用可能與靶向下調(diào)SOX4基因表達相關。