張毛帥，貴英英，李慧丹，梁萬前，李建華，林 飛，王學(xué)惠 (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南 衛(wèi)輝 453100)

流行病學(xué)和臨床研究表明，高同型半胱氨酸血癥(Hyperhomocysteine，HHcy)是致心血管疾病的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1-2]。在HHcy致心血管疾病的機(jī)制中， Hcy導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是其中一個(gè)重要的因素[3]。研究表明P66Shc甲基化狀態(tài)的改變，可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[4]。Hcy能否改變P66Shc甲基化狀態(tài)，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，研究報(bào)道較少。本研究以體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)為研究對象，觀察Hcy對細(xì)胞P66Shc DNA甲基化狀態(tài)的影響及DNA甲基化狀態(tài)改變后對血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響，為DNA甲基化介導(dǎo)Hcy致血管內(nèi)皮損傷提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Sciencell，美國Catalog Number 8000 Lot Number 15482 CA Number 0002748)、內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(Sciencell，美國)；同型半胱氨酸(Sigma，美國)；P66Shc antibody(武漢三鷹，中國)；Caspases-3抗體、兔二抗(Abcam，美國)；DNA提取試劑盒、DNA甲基化試劑盒(康為世紀(jì)，中國)；5-氮雜胞嘧啶核苷5-Azacytidine(Sigma，美國)，TUNEL試劑盒(碧云天，中國)。

1.2方法

1.2.1MTT法檢測細(xì)胞活性： 培養(yǎng)HUVECs融合約至80%，傳代至96孔板，4 000細(xì)胞/孔，第2天加入不同濃度的Hcy。應(yīng)用MTT法檢測不同濃度Hcy孵育24 h后HUVECs的活性。

1.2.2TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡：根據(jù)TUNEL試劑盒說明書[4%多聚甲醛固定、細(xì)胞通透、制備TUNEL反應(yīng)混合液、標(biāo)記反應(yīng)、終止反應(yīng)、封閉POD、酶標(biāo)反應(yīng)、DAB顯色(避光)、蘇木素復(fù)染]觀察Hcy和5-Azacytidine處理后臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況。

1.2.3檢測Hcy處理HUVECs中蛋白表達(dá)：培養(yǎng)HUVECs融合約至80%，傳代至6孔板，分別加入終濃度為 0 μmol/L,50 μmol/L,100 μmol/L，200 μmol/L的Hcy，孵育24 h后，提取蛋白。應(yīng)用WesternBlot技術(shù)檢測P66Shc、active-Caspase-3蛋白表達(dá)水平。

1.2.4DNA的提取及DNA甲基化特異性PCR：采用DNA提取試劑盒，提取誘導(dǎo)后HUVECs中的DNA。應(yīng)用DNA甲基化修飾試劑盒進(jìn)行甲基化修飾。依次把12.5 μl Taq mix、1.25 μl甲基化及1.25 μl未甲基化上下游引物、1 μl處理后DNA、9 μl超純水加入250 μl PCR管中。PCR儀按照95 ℃ 10 mins、95 ℃ 30 s、62 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s、Tm=2 ℃(A+T)+4 ℃(G+C)循環(huán)35次，72 ℃ 7 mins退火。并制備1%瓊脂糖凝膠，在254nm波長的透射紫外燈下觀察。P66Shc甲基化引物：上游引物：5′-TTTTCGTTTTTTGGGTTC-3′下游引物: 5′-TACGTATTCCTACCGAACG-3′；P66Shc未甲基化引物：上游引物：5′-TAATTTTTGTTTTTTGGGTTT-3′下游引物: 5′-TACATATTCCTACCAAACACAA-3′。

1.2.5檢測5-Azacytidine處理HUVECs中蛋白表達(dá)：培養(yǎng)HUVECs融合約至80%，傳代至6孔板，分別加入終濃度200 μmol/L的Hcy同時(shí)加入終濃度為0 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L的5-Azacytidine后，應(yīng)用WesternBlot技術(shù)檢測P66Shc、active-Caspase-3蛋白表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)：采用Graph-Pad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理：兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩組計(jì)量資料之間的相關(guān)性采用雙變量相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Hcy對HUVECs活性的影響：Hcy對細(xì)胞活力影響如圖1所示，隨著Hcy濃度的增加，細(xì)胞活力逐漸降低。

2.2Hcy和5-Azacytidine處理后細(xì)胞凋亡檢測：如圖2所示： 與對照組相比，Hcy處理后細(xì)胞凋亡增加，而加入5-Azacytidine處理后，可以明顯減輕細(xì)胞的凋亡。TUNEL染色陽性表現(xiàn)為細(xì)胞核呈深棕黃色如箭頭所示。

2.3Hcy處理HUVECs后P66Shc、active-Caspase-3蛋白表達(dá)水平：如圖3所示，與對照組相比，不同濃度Hcy(50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L)處理HUVEC均可以促進(jìn)P66Shc與active-Caspase-3的表達(dá)增加， 且Hcy致HUVECs損傷具有劑量依賴性。

2.4P66Shc特異性甲基化PCR：如圖4所示，P66Shc在對照組中甲基化狀態(tài)較強(qiáng)，在Hcy誘導(dǎo)組中未甲基化狀態(tài)較強(qiáng)。說明Hcy降低P66Shc DNA甲基化狀態(tài)。

*為P<0.05，**為P<0.01

注：A組：對照組 B組：Hcy組 C組:5-AZA組 D組：Hcy+5-AZA組

*為P<0.05,**為P<0.01

圖4 各組處理細(xì)胞中P66Shc甲基化檢測電泳圖

2.55-Azacytidine處理HUVECs后P66Shc、active-Caspase-3蛋白表達(dá)水平：如圖5所示，與單加200 μmol/L Hcy處理組相比，加入不同濃度5-AZA(10 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L)處理細(xì)胞后，均能降低P66Shc、active-Caspase-3蛋白表達(dá)水平，并且隨著5-AZA濃度的增加而逐漸減少。

3 討論

冠狀動脈粥樣硬化是冠心病的病理基礎(chǔ)，其發(fā)生發(fā)展常常造成嚴(yán)重心血管事件的發(fā)生。研究結(jié)果顯示，HHcy是致冠狀動脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[5]。HHcy導(dǎo)致冠狀動脈粥樣硬化發(fā)生的機(jī)制包括細(xì)胞氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體應(yīng)激反應(yīng)與凋亡、血管炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷等[6-7]。其中HHcy致血管內(nèi)皮損傷是導(dǎo)致心血管疾病的獨(dú)立預(yù)測因子。在HHcy致心血管疾病進(jìn)展的機(jī)制中，Hcy導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是較為重要的因素[8]。

*為P<0.05，**為P<0.01

近年來研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)修飾影響各類疾病的發(fā)生、發(fā)展，其機(jī)制為在基因序列不發(fā)生改變情況下，導(dǎo)致基因表型變化。L.Duan等報(bào)道[9]表觀遺傳學(xué)修飾與冠狀動脈粥樣硬化關(guān)系密切。在表觀遺傳學(xué)修飾引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷機(jī)制中，DNA甲基化能夠抑制轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[10]。在人組織樣本和小鼠模型中已經(jīng)證實(shí)DNA低甲基化能夠促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展[11-12]。Hcy參與蛋氨酸循環(huán)的轉(zhuǎn)甲基代謝，可以改變蛋白組及DNA的甲基化狀態(tài)[13]。這樣在表觀遺傳學(xué)修飾層面上，解釋了Hcy致冠狀動脈粥樣硬化的機(jī)制。

銜接蛋白P66Shc能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，是影響哺乳動物應(yīng)激凋亡反應(yīng)調(diào)控通路的一部分。銜接蛋白P66Shc通過其氧化還原酶活性刺激線粒體活性氧 (ROS)的產(chǎn)生以及一氧化氮(NO)損耗，加重血管內(nèi)皮損傷，在動脈粥樣硬化的病理生理過程中起著重要作用[14-15]。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者的外周血單核細(xì)胞(PBM)中，P66ShcmRNA表達(dá)與血清低密度脂蛋白膽固醇和Hcy水平呈顯著正相關(guān)[16]。另外P66Shc能夠介導(dǎo)Hcy誘導(dǎo)ROS功能失調(diào)及內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[17]。甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-AZA能夠抑制血管內(nèi)皮炎性損傷及動脈粥樣硬化的發(fā)展[18]。

筆者探討DNMT3b抑制劑的5-AZA是否能夠抑制P66Shc的表達(dá)并減少血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Hcy誘導(dǎo)HUVECs凋亡，促進(jìn)P66Shc的表達(dá)，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。驗(yàn)證了P66Shc調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用。另active-Caspase3是反映細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵指標(biāo)，能夠反映血管內(nèi)皮損傷程度，在Hcy致血管內(nèi)皮損傷中起到監(jiān)測作用[7]。檢測active-Caspase3表達(dá)程度能夠間接反應(yīng)P66Shc對血管內(nèi)皮損傷的作用[19]。本實(shí)驗(yàn)采用特異性甲基化檢測Hcy誘導(dǎo)P66Shc甲基化狀態(tài)變化及細(xì)胞凋亡程度的改變，判斷血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度。結(jié)果顯示：Hcy誘導(dǎo)P66Shc低DNA甲基化狀態(tài)及active-Caspase3蛋白表達(dá)增加，而5-Azacytidine抑制P66Shc及active-Caspase3蛋白表達(dá)。說明Hcy致 P66Shc的DNA低甲基化,使血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡產(chǎn)生血管內(nèi)皮損傷。但考慮5-AZA為DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑，理論上會降低P66Shc啟動子區(qū)甲基化而升高其表達(dá)，但結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道及本實(shí)驗(yàn)結(jié)果考慮可能存在其他結(jié)合位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白介導(dǎo)引起5-AZA起到血管內(nèi)皮保護(hù)性機(jī)制[20-21]。

綜上所述，Hcy能夠降低P66Shc的DNA甲基化,致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。本實(shí)驗(yàn)明確了Hcy調(diào)節(jié)DNA甲基化狀態(tài)致血管內(nèi)皮損傷的新機(jī)制，為研究Hcy致表觀遺傳學(xué)改變提供新的思路。結(jié)合DNMTs酶抑制劑-HDACIs已經(jīng)被作為治療癌癥及血液系統(tǒng)疾病的靶點(diǎn)，筆者相信DNA甲基化等表觀遺傳機(jī)制是治療心血管疾病的潛在靶點(diǎn)[22]。結(jié)合Hcy通過活化DNMT3b誘導(dǎo)P66Shc的表達(dá)，并促進(jìn)細(xì)胞氧化應(yīng)激的發(fā)生進(jìn)而造成血管內(nèi)皮損傷。SiRNA技術(shù)敲低DNMT3b，進(jìn)一步驗(yàn)證P66Shc甲基化程度及改變后血管內(nèi)皮損傷的程度[23]。另外通過誘導(dǎo)DNMTs表達(dá)及P66Shc靶點(diǎn)作用，能為治療Hcy代謝異常及胱硫醚β-合成酶(CBS)、亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR-C667T )基因突變所致心血管疾病及其他所致疾病提供新的診斷、治療策略。是否存在Hcy改變P66Shc甲基化狀態(tài)，進(jìn)而影響下游靶基因的表達(dá)改變使細(xì)胞凋亡程度增加，而最終造成血管內(nèi)皮損傷的形成仍待研究。由于基因內(nèi)甲基化的提出、DNA甲基化的復(fù)雜性、全組DNA甲基化動態(tài)變化仍不十分明確，DNA甲基化相關(guān)數(shù)據(jù)及Hcy誘導(dǎo)心血管疾病相關(guān)未知機(jī)制仍需要繼續(xù)探索[24-26]。