吳姍姍 魏慧霞 郭濱 殷學(xué)偉 劉德政 郭大東 畢宏生

近視是嚴(yán)重危害青少年眼部健康的常見疾病之一。目前，全世界近視患病率逐年上升，患者低齡化趨勢明顯。近視病因復(fù)雜，調(diào)節(jié)痙攣是近視形成的病因之一，而睫狀肌是引起調(diào)節(jié)反應(yīng)的關(guān)鍵組織，其在形態(tài)學(xué)和電生理學(xué)上具有平滑肌細(xì)胞的典型特征[1]。研究發(fā)現(xiàn)[2]，近視患者睫狀肌增厚，收縮性差，可影響近視的發(fā)展。表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)是一種多功能生長因子，廣泛分布于人體各組織中，而表皮生長因子受體 (epidermal growth factor receptor,EGFR)存在于除脈管系統(tǒng)之外的各種平滑肌組織中[3]。Yamaguchi等[3]首次證明EGF作用于EGFR會對睫狀肌的收縮產(chǎn)生直接影響。電針治療近視已在臨床上取得肯定療效[4-5],但其機(jī)制尚未完全明確。本研究旨在探討負(fù)透鏡誘導(dǎo)近視豚鼠睫狀肌中EGF和EGFR的表達(dá)變化，觀察電針對其表達(dá)的影響，初步闡釋睫狀肌中EGF和EGFR的表達(dá)變化在近視發(fā)展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組選取2周齡健康英國種三色短毛豚鼠90 只(濟(jì)南西嶺角生物科技有限公司)，體質(zhì)量100～120 g，入組前對眼部進(jìn)行篩查，以排除角膜病、先天性近視、白內(nèi)障等眼部疾患。采用隨機(jī)數(shù)字表法將豚鼠分為正常對照(normal control，NC)組、透鏡誘導(dǎo)型近視(lens-induced myopia,LIM)組、透鏡誘導(dǎo)型近視電針(lens-induced myopia+electroacupuncture,LIM+EA)組，每組各30只，各組均飼養(yǎng)2周和4周。NC組不作任何干預(yù)，LIM組、LIM+EA組豚鼠右眼均戴-6 D透鏡為造模眼，左眼不戴鏡作為自身對照眼；LIM+EA組在戴鏡同時進(jìn)行雙側(cè)太陽穴、合谷穴電針干預(yù)，每天同一時間電針干預(yù)30 min，頻率 2 Hz，強(qiáng)度2 mA。實驗過程中保持飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，自然照明環(huán)境下供給動物自由飲食，嚴(yán)格12 h/12 h 晝夜循環(huán)。

1.1.2 主要試劑與儀器10 g·L-1鹽酸環(huán)噴脫酯滴眼液(美國愛爾康公司)；4 mg·mL-1鹽酸奧布卡因(日本參天制藥株式會社)；組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒(山東思科捷科學(xué)儀器有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(含基因組去除劑)、化學(xué)修飾熱啟動實時熒光定量PCR試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型)(碧云天生物技術(shù)有限公司)；EGF試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司)；EGFR試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)； 電腦驗光儀(TOPCON,日本)；眼科A超(法國Quantel Medical 公司)；熒光顯微鏡(日本尼康)；Elx800酶標(biāo)儀(美國BioTek)。

1.2 方法

1.2.1 屈光度測量各組豚鼠于造模后2周、4周處死前均進(jìn)行屈光參數(shù)(近視屈光度)檢查。檢查前結(jié)膜囊內(nèi)用10 g·L-1鹽酸環(huán)噴脫酯散瞳藥滴眼3 次，每次1 滴，間隔10 min，滴眼后30 min 進(jìn)行屈光度檢查，每眼至少測6次，取其平均值。

1.2.2 眼軸長度測量各組豚鼠于造模后2周、4周應(yīng)用眼科A 超進(jìn)行眼軸長度測量，測量前用4 g·L-1鹽酸奧布卡因滴眼1 次，每次1滴，進(jìn)行眼球表面麻醉。儀器參數(shù)設(shè)置為:前房傳播速度為1557 m·s-1，玻璃體傳播速度為1540 m·s-1，晶狀體傳播速度為1723 m·s-1[6]。測量時將探頭輕觸角膜并使之垂直于角膜頂點，連續(xù)測量10 次，剔除明顯偏離的數(shù)值，取平均值，整個過程均由同一技師操作完成。

1.2.3 組織病理學(xué)觀察豚鼠睫狀肌形態(tài)各組于造模后2周、4周每組分別隨機(jī)選取3只豚鼠，100 g·L-1水合氯醛腹腔注射麻醉處死，摘取各組右眼立即置于眼球固定液中固定24 h,之后進(jìn)行眼球標(biāo)本脫水、包埋、切片,行HE染色,觀察睫狀肌的病理形態(tài)變化。

1.2.4 豚鼠睫狀肌中EGF、EGFR mRNA 表達(dá)水平檢測造模后2周、4周，每組分別隨機(jī)取6只豚鼠睫狀肌組織，用組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒提取組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用q-PCR技術(shù)檢測EGF、EGFR基因表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參基因。利用DNAStar軟件設(shè)計各引物序列，并由上海生工生物工程股份有限公司合成，其中EGF上游引物：5’-GCTCTGGCCTCCTCATAG-3’,下游引物：5’-TGTTTTGGCCAGTCCTCTTGTTCA-3’；EGFR上游引物：5’-CTGGGCGCGGAGGAGAAGGAGTA-3’,下游引物：5’-TGGGCGGCTATCTGCATCTATCAT-3’；GAPDH上游引物：5’-CTGACCTGCCGCCTGGAGAAACC-3’,下游引物：5’-ATGCCAGCCCCAGCGTCAAAAGT-3’。采用2-△△Ct方法對結(jié)果進(jìn)行分析，將NC組目的基因的相對表達(dá)量設(shè)置為1。

1.2.5 豚鼠睫狀肌中EGF、EGFR 蛋白表達(dá)水平檢測造模后2周、4周：分離各組豚鼠右眼睫狀肌組織，液氮研磨，按質(zhì)量體積比(20 mg200 μL)加入含苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)的放射免疫沉淀法緩沖液裂解液(radioimmunoprecipitation assay buffer,RIPA)，充分勻漿直至裂解完全，14 000 r·min-1離心4 min，取上清，用BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型)測定蛋白濃度。按照酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒步驟檢測EGF、EGFR蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 各組豚鼠屈光度和眼軸長度變化造模后2周、4周，LIM組造模眼(右眼)分別與自身對照眼及與NC組右眼相比，近視屈光度均增加(均為P<0.001)，眼軸均延長(2周：均為P<0.001；4周：P<0.01,P<0.001)。LIM+EA組造模眼分別與自身對照眼及與NC組右眼相比，近視屈光度均增加(均為P<0.001)，眼軸均延長(均為P<0.05)，且LIM+EA組造模眼與LIM組相比，近視屈光度均減小(均為P<0.01)，眼軸延長均減緩(均為P<0.05)，見表1。

表1 造模后2周、4周各組豚鼠屈光度和眼軸長度比較

組別屈光度/D右眼左眼眼軸長度/mm右眼左眼造模后2周 NC組2.25±0.532.02±0.428.24±0.058.23±0.07 LIM組-4.33±0.332.21±0.378.36±0.068.26±0.07 LIM+EA組-3.77±0.542.13±0.588.31±0.078.24±0.06造模后4周 NC組1.75±0.481.56±0.288.40±0.098.42±0.10 LIM組-5.96±0.461.83±0.258.55±0.078.44±0.07 LIM+EA組-2.46±0.441.69±0.368.48±0.078.43±0.06

2.2 各組豚鼠睫狀肌病理組織切片觀察造模后2周： NC組豚鼠睫狀肌纖維完整、排列有序； LIM組睫狀肌纖維斷裂、溶解，排列混亂； LIM+EA組睫狀肌纖維排列相對完整，排列較為有序。造模后4周：NC組豚鼠睫狀肌纖維完整、排列有序，與2周NC組相比排列較為疏松；LIM組豚鼠睫狀肌纖維斷裂、溶解，排列混亂，與2周相比，溶解更為徹底；LIM+EA組豚鼠睫狀肌纖維排列相對完整，排列較為有序，見圖1。

圖1 造模后2周、4周各組豚鼠睫狀肌病理組織切片觀察

2.3 各組豚鼠睫狀肌中EGF、EGFR mRNA表達(dá)水平造模后2周、4周， LIM組右眼睫狀肌中EGF mRNA、EGFR mRNA表達(dá)水平與NC組和LIM+EA組相比均明顯降低(均為P<0.05)，而NC組和LIM+EA組EGF mRNA、EGFR mRNA表達(dá)水平相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。見圖2、圖3。

2.4 各組豚鼠睫狀肌中EGF、EGFR蛋白表達(dá)造模后2周、4周， LIM組右眼睫狀肌中EGF 蛋白表達(dá)水平分別與NC組和LIM+EA組相比均明顯降低(P2周<0.001，P2周<0.01；P4周<0.001,P4周<0.05)，且LIM組EGFR 蛋白表達(dá)水平與NC組和LIM+EA組相比均明顯降低(均為P2周<0.01;P4周<0.01,P4周<0.05)，而NC組和LIM+EA組EGF、EGFR蛋白表達(dá)水平相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)，見圖4、圖5。

圖2 造模后2周、4周各組豚鼠睫狀肌中EGF mRNA表達(dá)水平 *：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001 圖3 造模后2周、4周各組豚鼠睫狀肌中EGFR mRNA表達(dá)水平 **：P<0.01，***：P<0.001 圖4 造模后2周、4周各組豚鼠睫狀肌中EGF 蛋白表達(dá)水平 *：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001 圖5 造模后2周、4周各組豚鼠睫狀肌中EGFR 蛋白表達(dá)水平 *：P<0.05，**：P<0.01

3 討論

經(jīng)典的近視誘導(dǎo)方法主要有形覺剝奪性近視和透鏡誘導(dǎo)型近視兩種。本實驗采用負(fù)透鏡誘導(dǎo)豚鼠制備近視模型，很好地模擬了近距離工作在人眼近視發(fā)生發(fā)展中的作用，為研究電針干預(yù)近視豚鼠睫狀肌中EGF及EGFR的變化奠定了模型基礎(chǔ)。

有研究表明[7-8]，EGF可通過影響視網(wǎng)膜-鞏膜信號通路上的相關(guān)因子的活性促進(jìn)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和鞏膜細(xì)胞的增殖，提示EGF的水平變化可能影響近視發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，近視豚鼠睫狀肌中EGF表達(dá)水平明顯下調(diào)，而電針干預(yù)后近視豚鼠睫狀肌中EGF表達(dá)水平上調(diào)且近視發(fā)展有所延緩，提示電針干預(yù)近視豚鼠可影響睫狀肌中EGF的表達(dá)水平并可延緩近視發(fā)展。EGF可影響平滑肌細(xì)胞的收縮[9-10]，且組織和細(xì)胞代謝水平的差異會導(dǎo)致EGFR表達(dá)和EGF在平滑肌細(xì)胞的結(jié)合位點不同，而代謝活躍的細(xì)胞具有高水平的EGFR表達(dá)[11]。此外，EGFR參與血管平滑肌收縮受氧化還原及氧氣水平的調(diào)節(jié)[12]。由此可見，氧氣含量低或代謝水平低的組織EGFR表達(dá)水平低，這與本研究結(jié)果高度一致。

本研究通過觀察睫狀肌中EGF及其受體EGFR的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)二者在近視模型組均下調(diào)表達(dá)，并隨近視程度加深表達(dá)量下降，而在電針干預(yù)近視模型組中二者均恢復(fù)性上調(diào)表達(dá)，且與正常對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示EGF及其受體EGFR在睫狀肌中的表達(dá)水平與近視的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，而電針干預(yù)治療可以顯著提高二者的表達(dá)水平，對近視的治療有一定的作用，其可能的機(jī)制是近視過程中睫狀肌收縮痙攣，導(dǎo)致組織缺血缺氧，代謝能力下降，隨著EGF及其受體EGFR表達(dá)下降，細(xì)胞分裂增殖能力降低，數(shù)目減少，調(diào)節(jié)能力下降，最終導(dǎo)致近視發(fā)生；針刺眼部穴位太陽穴可以調(diào)節(jié)眼部組織血流和經(jīng)絡(luò)，清除代謝廢物及阻塞，提升睫狀肌組織的代謝能力，使EGF及EGFR表達(dá)上調(diào)。然而，睫狀肌中EGF與EGFR結(jié)合后參與肌肉組織形態(tài)及功能改變的具體信號分子及其通過的具體機(jī)制尚未完全明確，仍需進(jìn)一步設(shè)計實驗探索其可能的分子機(jī)制，為研究近視發(fā)生發(fā)展過程中睫狀肌的作用提供有效的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。