許鵬飛，程志敏，胡裕升，朱玉博，楊 錕，任立偉，龔大春*

（1.三峽大學(xué) 中國(guó)輕工業(yè)功能酵母重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學(xué) 湖北省生物酵素工程技術(shù)研究中心，湖北 宜昌 443002）

微生物油脂是酵母、藻類等微生物在一定條件下將碳水化合物轉(zhuǎn)化而生成的一種特殊脂肪酸甘油酸三脂[1]。其成分以C16和C18為主，可作為生物柴油的原料。利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)油脂不僅成本低，而且可進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)[2]，這樣便可避免為了生產(chǎn)生物柴油而與人爭(zhēng)糧爭(zhēng)地的情況[3-4]。

但現(xiàn)階段微生物油脂的產(chǎn)量還不能滿足產(chǎn)業(yè)化要求[5]，因此目前主要從菌種的改造[6]和發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)化[7]來提高其產(chǎn)量。利用響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基來獲得更高的油脂產(chǎn)量是一種高效可行的策略。鐘琦等[8]利用響應(yīng)面優(yōu)化粘性酵母的發(fā)酵條件，使菌株油脂產(chǎn)量達(dá)到5.2 g/L；KARPAGAM R等[9]通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)，將菌株的油脂產(chǎn)量從365 mg/L提升至580 mg/L。

本試驗(yàn)以前期誘變得到的高產(chǎn)油脂酵母[10]為出發(fā)菌株，利用單因素試驗(yàn)考察菌株產(chǎn)油脂的碳、氮源成分及含量，并通過添加外源因子來調(diào)節(jié)油脂合成途徑。再對(duì)單因素得到的最佳條件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化菌株產(chǎn)油脂的發(fā)酵培養(yǎng)基成分，以期為進(jìn)一步提高油脂產(chǎn)量提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

皮狀絲孢酵母（Trichosporon cutaneum）：實(shí)驗(yàn)室前期常壓室溫等離子體（atmospheric room temperature plasma，ARTP）誘變所得，保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（China CenterforTypeCultureCollection，CCTCC），保藏號(hào)為CCTCC M 2018318。

1.1.2 試劑

葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、麥芽糖、MgSO4、Na2HPO4、KH2PO4、NH4C1、MgCl2、Na2SO4、氯仿、甲醇（均為分析純）：科密歐化學(xué)試劑有限公司；酵母浸粉、酵母浸膏、麥芽浸粉、蛋白胨、瓊脂粉（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母膏胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）瓊脂培養(yǎng)基：酵母膏1 g/L，蛋白胨2 g/L，葡萄糖2 g/L，瓊脂粉2 g/L。

種子液培養(yǎng)基[11]：蔗糖25 g/L，酵母浸膏6 g/L，麥芽浸粉5 g/L，Na2HPO44 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基[12]：葡萄糖70 g/L，酵母浸粉0.75 g/L，NH4C1 0.1 g/L，MgCl21 g/L，Na2SO40.1 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ-CT-ZA潔凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；SX-700自動(dòng)滅菌鍋、MX-307落地高速冷凍離心機(jī)：日本TOMY公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；ZQLY-180振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化

將甘油管保藏的菌株用竹簽接種到Y(jié)PD平板培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2 d。

1.3.2 種子液培養(yǎng)

挑取平板上的單菌落接種到裝液量為100 mL/250 mL種子液培養(yǎng)基中，并用8層紗布封口處理，在28 ℃、200 r/min的搖床中培養(yǎng)18 h。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)

將生長(zhǎng)處于對(duì)數(shù)期的種子液，按10%的接種量，接種到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃、200 r/min的搖床中培養(yǎng)7 d。

1.3.4 生物量測(cè)定與油脂提取

將發(fā)酵培養(yǎng)7 d的發(fā)酵液，準(zhǔn)確吸取30 mL于烘干稱質(zhì)量的離心管中，10 000 r/min離心3 min，棄上清液，加入適量去離子水重懸，離心去上清。放入100 ℃烘箱中，烘干至恒質(zhì)量，計(jì)算生物量。按每克菌體加入8 mL 的8 mol/L鹽酸，搖勻后室溫靜置1 h，再進(jìn)行沸水浴加熱10 min，冷卻后再沸水浴5 min[13]。待溫度降至室溫后，加入氯仿和甲醇溶液進(jìn)行多次萃取，將收集到的氯仿層蒸發(fā)除去氯仿，得到微生物油脂[14-15]。生物量和油脂產(chǎn)量的計(jì)算公式如下：

1.3.5 單因素試驗(yàn)

利用單因素試驗(yàn)，考察發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源（蔗糖、阿拉伯糖、木糖、麥芽糖）、氮源（酵母浸粉、氯化銨、蛋白胨、玉米漿干粉、硫酸銨）、外源因子（乙酸鈉、蘋果酸）對(duì)油脂積累的影響，得出最佳的碳源、氮源與外源因子后，研究其最佳添加量。在進(jìn)行單因素試驗(yàn)時(shí)，其他條件保持不變。

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)油脂積累條件的優(yōu)化

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experimental design

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Box-Behnken試驗(yàn)，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)方案，最后對(duì)所得到的預(yù)測(cè)條件進(jìn)行驗(yàn)證。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 皮狀絲孢酵母生長(zhǎng)曲線

圖1 皮狀假絲酵母生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Trichosporon cutaneum

皮狀絲孢酵母的生長(zhǎng)曲線如圖1所示。由圖1可知，在接種后的8 h內(nèi)，菌體一直處于遲緩期，在此階段菌體不斷適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境，菌體數(shù)量基本保持不變；在8～20 h時(shí)，菌體經(jīng)過前期的適應(yīng)準(zhǔn)備，在此時(shí)期菌體此時(shí)期菌體生長(zhǎng)速率達(dá)到最大，數(shù)量極速增長(zhǎng)；在20 h以后，菌體生長(zhǎng)緩慢，基本處于穩(wěn)定期。因此，選擇培養(yǎng)18 h左右生長(zhǎng)旺盛的菌種作為轉(zhuǎn)接的種子液。

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.2.1 碳源種類及對(duì)皮狀絲孢酵母油脂積累的影響[16]

圖2 碳源種類對(duì)油脂積累的影響Fig.2 Effect of carbon source types on oil accumulation

從圖2可以看出，皮狀絲孢酵母可以利用六碳糖、五碳糖、雙糖等碳源進(jìn)行發(fā)酵生成油脂，這將有利于其利用木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物來進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。當(dāng)使用葡萄糖、蔗糖、木糖發(fā)酵時(shí)，菌株的生長(zhǎng)相差不大，但在油脂積累方面，木糖的產(chǎn)油能力明顯低于葡萄糖，這可能與木糖的復(fù)雜代謝相關(guān)[17]。用葡萄糖培養(yǎng)時(shí)，菌株不管是在生物量還是油脂產(chǎn)量方面都高于其他碳源，這與微生物對(duì)葡萄糖的偏好性以及葡萄糖可直接糖酵解產(chǎn)生丙酮酸而進(jìn)行油脂合成有關(guān)[18]。因此，選擇葡萄糖作為碳源來進(jìn)行后續(xù)的發(fā)酵培養(yǎng)。

2.2.2 葡萄糖添加量對(duì)皮狀絲孢酵母油脂積累的影響

圖3 葡萄糖添加量對(duì)油脂積累的影響Fig.3 Effect of glucose addition on oil accumulation

從圖3可以看出，在葡萄糖添加量為50～90 g/L時(shí)，隨著葡萄糖添加量的增大，菌體的生物量和油脂產(chǎn)量都呈上升趨勢(shì)。當(dāng)葡萄糖添加量為50 g/L時(shí)，其油脂產(chǎn)量?jī)H為2.7 g/L，油脂系數(shù)僅為5.5 g/100 g；而當(dāng)葡萄糖添加量提升至90 g/L時(shí)，其油脂產(chǎn)量達(dá)到了7.2 g/L，油脂系數(shù)達(dá)到了8.6 g/100 g，可見葡萄糖對(duì)菌株的油脂積累有很大影響。但當(dāng)葡萄糖添加量繼續(xù)增大時(shí)，菌株的生物量、油脂產(chǎn)量均出現(xiàn)了降低，在葡萄糖添加量為150 g/L時(shí)，油脂系數(shù)為4.2 g/100 g，較葡萄糖添加量為90 g/L時(shí)，降低了50%，可見高濃度的葡萄糖抑制了菌株的生長(zhǎng)和油脂積累。因此，最佳葡萄糖添加量90 g/L。

2.2.3 氮源對(duì)皮狀絲孢酵母油脂積累的影響

圖4 氮源種類對(duì)油脂積累的影響Fig.4 Effect of nitrogen source types on oil accumulation

由圖4可以看出，在用無機(jī)氮源培養(yǎng)時(shí)，菌株的生長(zhǎng)和油脂產(chǎn)量均較差，僅有5.5 g/L的生物量和2.9 g/L的油脂產(chǎn)量，而用有機(jī)氮源進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，菌株生長(zhǎng)狀況良好，而且油脂的積累量大，當(dāng)?shù)礊橛衩诐{干粉時(shí)，菌株的生物量、油脂產(chǎn)量和油脂系數(shù)分別達(dá)到了15.2 g/L、9.3 g/L和10.3g/100 g。這可能是因?yàn)橛衩诐{干粉中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、無機(jī)鹽和生長(zhǎng)因子等成分[19-20]，易于被菌株利用。

2.2.4 玉米漿干粉添加量對(duì)皮狀絲孢酵母油脂積累的影響

圖5 玉米漿干粉添加量對(duì)油脂積累的影響Fig.5 Effect of corn syrup dry powder addition on oil accumulation

從圖5可以看出，玉米漿干粉添加量對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有很大影響，隨著玉米漿干粉的添加量增加，細(xì)胞的生物量從18 g/L提高至25 g/L。但其油脂產(chǎn)量并沒有和生物量正相關(guān)，而是在添加量為4 g/L的玉米漿干粉添加量時(shí)油脂產(chǎn)量達(dá)到了最大。在玉米漿干粉添加量更高時(shí)，菌株主要表現(xiàn)為生物量的增加，此時(shí)，培養(yǎng)基中的碳源大部分用于了細(xì)胞的生長(zhǎng)和非油脂合成代謝過程，出現(xiàn)了油脂產(chǎn)量降低的情況。這說明氮源的用量在高濃度區(qū)域時(shí)，生物量與油脂的合成屬于非正相關(guān)。因此，最適玉米漿干粉添加量為4 g/L。

2.2.5 外源因子對(duì)皮狀絲孢酵母油脂積累的影響[21-22]

圖6 乙酸鈉添加量對(duì)油脂積累的影響Fig.6 Effect of sodium acetate addition on oil accumulation

乙酰輔酶A是脂肪酸合成和能量代謝的關(guān)鍵物質(zhì)，乙酸鈉可以為乙酰輔酶A的合成提供前體物質(zhì)，從而提高乙酰輔酶A水平[23]，進(jìn)而可以使脂肪酸合成有更多的底物供應(yīng)[24]。由圖6可知，當(dāng)乙酸鈉的添加量為0.1 g/L時(shí)油脂的積累有少量提高，當(dāng)繼續(xù)增大添加量后，乙酸鈉對(duì)菌株產(chǎn)生了一定的毒性[25]，使菌株油脂積累能力明顯下降。

圖7 蘋果酸對(duì)油脂積累的影響Fig.7 Effect of malic acid addition on oil accumulation

脂肪酸合成的另一個(gè)關(guān)鍵物質(zhì)就是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）[26]，其主要來源于蘋果酸酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶。蘋果酸酶可催化蘋果酸氧化脫羧生成丙酮酸，在此過程中便可生成NADPH，用于脂肪酸合成[27-28]。在培養(yǎng)基中添加微量的蘋果酸來增加催化底物，從而產(chǎn)生更多的還原力，由圖7可知，將蘋果酸添加到培養(yǎng)基中對(duì)油脂積累沒有明顯的影響，甚至在高濃度時(shí)對(duì)微生物的油脂積累出現(xiàn)了抑制效果，這可能是蘋果酸的添加影響了發(fā)酵液的pH。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取葡萄糖添加量（A）、玉米漿干粉添加量（B）和乙酸鈉添加量（C）3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，以油脂產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments

2.3.2 模型建立與方差分析

利用Design Expert 8.0軟件對(duì)表2的結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程：Y=14.02+1.34A+0.74B-0.2C+0.95AB+0.025AC-0.025BC-2.24A2-1.48B2-0.91C2，而且決定系數(shù)R2=0.994 6表示有99.46%的數(shù)據(jù)可以用該模型來解釋，調(diào)整決定系數(shù)說明該方程的擬合性較好，可以用來進(jìn)行分析。

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可看出，模型P＜0.000 1表明此模型極顯著，失擬項(xiàng)P=0.075 9＞0.05，說明失擬項(xiàng)不顯著。回歸方程中葡萄糖和玉米漿干粉的一次項(xiàng)P＜0.000 1，達(dá)到了極顯著的水平，說明在試驗(yàn)范圍內(nèi)這兩個(gè)因素對(duì)油脂的積累有極顯著性的影響。在交叉項(xiàng)中葡萄糖和玉米漿干粉的交互作用（AB）對(duì)油脂影響極顯著（P＜0.000 1），二次項(xiàng)中三個(gè)因素對(duì)油脂的積累影響均極顯著（P＜0.000 1）。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface experiments results

2.3.3 響應(yīng)面圖分析

各因素交互作用對(duì)菌株發(fā)酵油脂產(chǎn)量結(jié)果的影響見圖8。由圖8可知，當(dāng)3個(gè)因素中其中一個(gè)固定為零水平時(shí)，其他兩個(gè)因素存在交互作用且存在一個(gè)油脂產(chǎn)量最大的組合點(diǎn)[29]。在3組交互影響的圖中，可以看出當(dāng)其中一個(gè)因素固定時(shí)，隨著另一因素的增大，油脂產(chǎn)量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。

2.3.4 響應(yīng)面預(yù)測(cè)與驗(yàn)證

對(duì)得到的回歸方程求解油脂產(chǎn)量的極大值，得出培養(yǎng)基起始葡萄糖、玉米漿干粉、乙酸鈉的添加量分別為：97.6 g/L、4.4 g/L、0.09 g/L時(shí)，預(yù)測(cè)的菌株油脂產(chǎn)量可達(dá)14.4 g/L。在此條件下進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，得出平均油脂產(chǎn)量實(shí)際值為14.4 g/L，與預(yù)測(cè)值相吻合。說明本次實(shí)驗(yàn)的模型對(duì)皮狀絲孢酵母發(fā)酵產(chǎn)油脂具有一定的指導(dǎo)意義。

圖8 各因素交互作用對(duì)油脂積累影響的響應(yīng)面和等高線Fig.8 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on oil accumulation

3 結(jié)論

本研究以微生物油脂產(chǎn)量為目標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)優(yōu)化，建立了一個(gè)油脂產(chǎn)量與三個(gè)因素的數(shù)學(xué)模型，此模型能很好的擬合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其預(yù)測(cè)條件與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)基本吻合。得到皮狀絲孢酵母發(fā)酵產(chǎn)油脂的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖97.6 g/L、玉米漿干粉4.4 g/L、乙酸鈉0.09 g/L。在此條件下菌株的油脂產(chǎn)量達(dá)到了14.4 g/L。玉米漿干粉的加入大大促進(jìn)了菌體的生長(zhǎng)，本研究對(duì)生物油脂產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供一定科學(xué)依據(jù)。