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        香菇酶解液熱反應(yīng)條件優(yōu)化

        2020-05-12 07:00:16劉麗娜魏書信王安建田廣瑞高帥平邢彩云
        中國釀造 2020年3期
        關(guān)鍵詞:解液木糖香菇

        劉麗娜,魏書信,王安建,田廣瑞,高帥平,邢彩云

        (1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心,河南 鄭州 450002;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,河南 鄭州 450002)

        香菇(Lentinus edodes)是我國特產(chǎn)食用菌,也是食用菌中最具有代表性的品種之一,不僅肉質(zhì)肥厚脆嫩,滋味鮮美,香氣獨(dú)特,而且具有很高的營養(yǎng)、藥用和保健價(jià)值[1],深受人們的喜愛。據(jù)中國食用菌協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì),2017年我國香菇產(chǎn)量986.51萬t,占全國食用菌總產(chǎn)量的26%以上,是產(chǎn)量最大的食用菌品種。近年來,隨著人們生活水平的不斷提高,香菇國際國內(nèi)市場(chǎng)日益擴(kuò)大,香菇加工開始向多元化方向發(fā)展,對(duì)香菇產(chǎn)品的開發(fā)已有很多研究報(bào)道[2-7],如香菇面包、香菇餅干、香菇保健茶、香菇酥糖、香菇熱狗腸、香菇醬等。由于香菇含有豐富的呈味物質(zhì),獨(dú)特的鮮美滋味使其深加工成為調(diào)味料開發(fā)的重要方向。目前在調(diào)味料上還是以粗加工為主,工藝簡單,香菇的鮮味和滋味物質(zhì)釋放不完全,特征香氣不明顯,因此有必要研究開發(fā)一種香菇深加工風(fēng)味產(chǎn)品。

        熱反應(yīng)技術(shù)是改進(jìn)食品風(fēng)味和制取新型風(fēng)味物質(zhì)的重要手段,廣泛應(yīng)用于香精領(lǐng)域,利用各種不同糖類和氨基酸化合物的熱反應(yīng)能產(chǎn)生各種不同的風(fēng)味物質(zhì)[8-9],熱反應(yīng)的程度和系統(tǒng)中的組分、溫度、時(shí)間以及pH值等條件有關(guān)[10]。各種深入研究發(fā)現(xiàn)采用合適的天然原料,如水解動(dòng)物蛋白、水解植物蛋白等代替氨基酸來制備香精,可以使得產(chǎn)品的風(fēng)味更佳飽滿逼真[11]。目前,國內(nèi)外對(duì)香菇的研究主要集中在栽培技術(shù)、干制加工、功能成分提取及活性研究等,對(duì)干香菇的揮發(fā)性香味成分分析研究的也較多,而對(duì)其熱反應(yīng)香精的風(fēng)味研究鮮見報(bào)道,香菇中氨基酸豐富,含有構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸中的18種,且含有豐富的糖類,這些都是制備熱反應(yīng)香精的風(fēng)味前提物質(zhì)。因此,本研究選用香菇酶解液為原料,添加外源氨基酸和還原糖進(jìn)行熱反應(yīng),制備一款具有菌菇風(fēng)味、能增香增鮮的新型食品調(diào)味料,以期為香菇的精深加工提供一條新途徑。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        香菇:購自西峽縣孫氏菌業(yè)專業(yè)合作社,烘干后粉碎過80目篩,取篩下物密封保存?zhèn)溆?;中性蛋白酶(酶?.8AU/g):諾維信投資有限公司;氫氧化鈉、木糖、L-半胱氨酸(均為分析純):國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;濃鹽酸(分析純):煙臺(tái)市雙雙化工有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        ZX-9140MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱、SHZ-B水浴恒溫振蕩器:上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;XB-20B多功能粉碎機(jī):上海兆申科技有限公司;FA2004C分析天平:上海越平科學(xué)儀器有限公司;超聲波細(xì)胞破碎儀:上海汗諾軒儀器有限公司;HC-3018高速冷凍離心機(jī):安徽中科中加科學(xué)儀器有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器:河南省予華儀器有限公司;FE20 pH計(jì):梅特勒-托利多儀器上海有限公司;UV-1800型紫外可見分光光度計(jì):濟(jì)南海能儀器股份有限公司;MJ-78A高壓滅菌鍋:施都凱儀器設(shè)備上海有限公司;Advanced-Ⅰ艾柯超純水機(jī):臺(tái)灣艾柯成都康寧實(shí)驗(yàn)專用純水設(shè)備廠;Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)儀:美國Agilent公司;固相微萃取手柄、50 μmDVB/CAR/PDMS萃取頭:美國Supelco公司。

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        1.3.1 香菇酶解液的制備

        取適量香菇粉,按照料液比1∶15(g∶mL)加去離子水混合均勻,超聲細(xì)胞破碎儀作用10 min(超聲功率800W、頻率20 kHz),添加0.7%中性蛋白酶在50 ℃酶解3 h后,沸水浴滅酶10 min,冷卻,4 000 r/min離心20 min,取上清液即為酶解液(其水解度為18.36%)。

        1.3.2 熱反應(yīng)制備菇精的試驗(yàn)

        (1)熱反應(yīng)原料的確定

        稱取香菇酶解液40 g,分別加入不同含量木糖(0.2 g、0.4 g、0.6 g、0.8 g、1.0 g)、不同含量半胱氨酸(0.05 g、0.10 g、0.15 g、0.20 g、0.25 g),在100 ℃反應(yīng)2 h,考察熱反應(yīng)原料對(duì)熱反應(yīng)的影響,通過感官評(píng)分和熱反應(yīng)中間產(chǎn)物A280nm值來確定熱反應(yīng)原料的添加量。

        (2)熱反應(yīng)條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

        稱取香菇酶解液40 g,添加木糖0.6 g和半胱氨酸0.1 g,考察不同反應(yīng)溫度(80 ℃、90 ℃、100 ℃、110 ℃、120 ℃),不同反應(yīng)時(shí)間(0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h),不同反應(yīng)pH值(5、6、7、8、9)對(duì)熱反應(yīng)的影響,通過感官評(píng)分和熱反應(yīng)中間產(chǎn)物A280nm值來確定熱反應(yīng)條件。

        (3)熱反應(yīng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

        表1 熱反應(yīng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for thermal reaction conditions optimization

        在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo),選擇反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)pH值3個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn),對(duì)熱反應(yīng)條件參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

        1.3.3 分析檢測(cè)

        (1)熱反應(yīng)中間產(chǎn)物的檢測(cè)[12]

        熱反應(yīng)產(chǎn)物中的低分子質(zhì)量香味中間體可以用280 nm波長處紫外吸光度值表示,吸光度值越大,香味物質(zhì)越多。將熱反應(yīng)產(chǎn)物稀釋100倍,以蒸餾水作為參比溶液,在280 nm波長處測(cè)定吸光度值。

        (2)熱反應(yīng)產(chǎn)物的感官評(píng)價(jià)[13]

        由五位有感官評(píng)定經(jīng)驗(yàn)的評(píng)定人員從焦香味、糊味、香菇特征香氣、整體香氣4個(gè)方面對(duì)熱反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行感官評(píng)定。焦香味、糊味、香菇特征香氣和整體香氣所占的權(quán)重分別是20%、20%、30%和30%,感官評(píng)分取加權(quán)平均數(shù),總分9分。熱反應(yīng)產(chǎn)物感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

        表2 熱反應(yīng)產(chǎn)物感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of thermal reaction products

        (3)氣質(zhì)聯(lián)用分析[14]

        固相微萃?。╯olid-phase microextraction,SPME)條件:取10 mL樣液放入40 mL萃取瓶中,蓋上瓶蓋在60 ℃水浴攪拌中平衡20 min后,用萃取頭吸附30 min,然后將萃取頭插入氣質(zhì)聯(lián)用儀的進(jìn)樣器中解吸5 min。

        氣相色譜條件:采用HP-5MS毛細(xì)色譜柱(30m×0.25mm×0.25 μm),載氣氦氣(He),流速1 mL/min,不分流,進(jìn)樣口溫度230 ℃;程序升溫起始溫度35 ℃,保持5 min,5 ℃/min升溫至150 ℃,再以10 ℃/min的速率升至220 ℃,保持2 min,檢測(cè)器溫度:280 ℃。質(zhì)譜條件:電離方式為電子電離(electronic ionization,EI)源,電子能量為70 eV,離子源溫度為230 ℃,四極桿溫度150 ℃,質(zhì)譜接口溫度250 ℃,質(zhì)量掃描范圍30~550m/z。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 熱反應(yīng)原料的確定

        2.1.1 木糖添加量的確定

        還原糖是熱反應(yīng)中重要的反應(yīng)物質(zhì),木糖價(jià)廉易得,反應(yīng)活性好,是呋喃類物質(zhì)產(chǎn)生的良好前體物,還能促進(jìn)焦香味和甜味產(chǎn)物產(chǎn)生[15-16]。由圖1可知,在40 g香菇酶解液中,隨著木糖添加量的增加熱反應(yīng)中間產(chǎn)物A280nm值逐漸增加并趨于平緩,說明木糖增加使熱反應(yīng)程度增大并產(chǎn)生更多的風(fēng)味物質(zhì)。熱反應(yīng)產(chǎn)物的感官評(píng)分隨木糖添加量的增加不斷升高,但木糖添加量為0.7 g時(shí)感官評(píng)分反而低于0.6 g時(shí),這可能是由于木糖添加量過多,發(fā)生過度焦糖化反應(yīng),導(dǎo)致產(chǎn)物產(chǎn)生焦糊味使感官評(píng)分降低。綜合考慮木糖的最適添加量為0.6 g。

        圖1 木糖添加量對(duì)熱反應(yīng)的影響Fig.1 Effect of xylose addition on thermal reaction

        2.1.2 半胱氨酸添加量的確定

        圖2 半胱氨酸添加量對(duì)熱反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of cysteine addition on thermal reaction

        香菇中蛋白質(zhì)含量很高,且氨基酸種類豐富[17],酶解后是一種理想的熱反應(yīng)原料。不同的氨基酸在熱反應(yīng)中會(huì)產(chǎn)生不同的風(fēng)味,在香菇酶解液中添加一定量的半胱氨酸,有助于形成更多的香味物質(zhì)[18]。由圖2可知,在40 g香菇酶解液中,隨著半胱氨酸添加量的不斷增加,熱反應(yīng)中間產(chǎn)物A280nm值和熱反應(yīng)產(chǎn)物的感官評(píng)分均呈先上升后下降的趨勢(shì),二者變化趨勢(shì)相似,半胱氨酸添加量為0.1 g時(shí)A280nm值和感官評(píng)分最高。半胱氨酸添加量太多會(huì)造成熱反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)生硫味,使感官評(píng)分降低。因此,半胱氨酸添加量選擇0.1 g。

        2.2 熱反應(yīng)條件的單因素試驗(yàn)

        2.2.1 反應(yīng)溫度對(duì)熱反應(yīng)的影響

        在初始pH值為6的條件下反應(yīng)2 h,溫度對(duì)熱反應(yīng)的影響見圖3。由圖3可知,反應(yīng)溫度較低時(shí),熱反應(yīng)較為緩慢,此時(shí),熱反應(yīng)中間產(chǎn)物A280nm值和熱反應(yīng)產(chǎn)物的感官評(píng)分都處于較低水平;隨著溫度的升高,反應(yīng)底物活性增加,熱反應(yīng)進(jìn)程不斷加速,溫度每升高10 ℃,反應(yīng)速率增加3~5倍,熱反應(yīng)產(chǎn)物增加,因此,熱反應(yīng)中間產(chǎn)物A280nm值升高趨勢(shì)加快,熱反應(yīng)產(chǎn)物的感官評(píng)分逐漸增加;但反應(yīng)溫度過高熱反應(yīng)產(chǎn)物會(huì)產(chǎn)生焦味和異味,致使熱反應(yīng)產(chǎn)物的感官評(píng)分下降明顯。因此,最適的反應(yīng)溫度為100 ℃,這與張書香等[19]研究結(jié)果相一致。

        圖3 反應(yīng)溫度對(duì)熱反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on thermal reaction

        2.2.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)熱反應(yīng)的影響

        圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)熱反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of reaction time on thermal reaction

        在反應(yīng)溫度100 ℃、初始pH值為6的條件下,反應(yīng)時(shí)間對(duì)熱反應(yīng)的影響見圖4。由圖4可知,反應(yīng)時(shí)間較短時(shí),熱反應(yīng)發(fā)生不完全,產(chǎn)物生成較少,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長,熱反應(yīng)發(fā)生充分,產(chǎn)物含量增加,因此,熱反應(yīng)中間產(chǎn)物A280nm值和熱反應(yīng)產(chǎn)物的感官評(píng)分逐漸增加;但時(shí)間延長到2 h后,會(huì)出現(xiàn)焦糊味影響熱反應(yīng)液的可接受性,從而引起感官評(píng)分降低。因此,反應(yīng)時(shí)間選擇2 h為宜。

        2.2.3 反應(yīng)pH值對(duì)熱反應(yīng)的影響

        在反應(yīng)溫度100 ℃、時(shí)間2 h的條件下,采用不同反應(yīng)pH值進(jìn)行熱反應(yīng),結(jié)果見圖5。由圖5可知,不同的起始反應(yīng)pH值對(duì)熱反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味存在影響[20]。隨著pH值的升高,熱反應(yīng)中間產(chǎn)物A280nm值不斷增加,這符合熱反應(yīng)在pH 3~10時(shí)隨著pH升高而加劇的一般規(guī)律。熱反應(yīng)產(chǎn)物的感官評(píng)分隨著pH值的升高先升后降,當(dāng)pH值達(dá)到6.0以上時(shí),由于氨基的反應(yīng)性加強(qiáng),熱反應(yīng)速度加快,導(dǎo)致產(chǎn)生不良風(fēng)味[21](如NH3等)。因此,選擇最適反應(yīng)pH值為6。

        圖5 反應(yīng)pH值對(duì)熱反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of reaction pH value on thermal reaction

        2.3 熱反應(yīng)條件的優(yōu)化

        根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,以感官評(píng)分為考察指標(biāo),對(duì)熱反應(yīng)溫度、時(shí)間、pH值進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn),結(jié)果與分析見表3,方差分析見表4。

        表3 熱反應(yīng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for thermal reaction conditions optimization

        由表3可知,經(jīng)極差分析可知,3個(gè)因素對(duì)感官評(píng)分的影響從大到小的順序?yàn)锳>C>B,即反應(yīng)溫度影響最大,其次是反應(yīng)pH值和反應(yīng)時(shí)間。最優(yōu)水平組合為A2B1C3,即反應(yīng)溫度為100 ℃,反應(yīng)時(shí)間為1.5 h,反應(yīng)pH值為7。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn),其反應(yīng)產(chǎn)物感官評(píng)分為8.8。由表4方差分析可知,反應(yīng)溫度對(duì)感官評(píng)分影響顯著(P<0.05),而反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)pH值對(duì)感官評(píng)分無顯著影響(P>0.05)。

        表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal tests results

        2.4 香菇酶解液熱反應(yīng)后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

        將所得最優(yōu)組合條件下的熱反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)GC-MS分析,熱反應(yīng)產(chǎn)物的揮發(fā)性成分總離子流色譜圖見圖6,分離鑒定出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成及相對(duì)含量見表5。

        圖6 熱反應(yīng)產(chǎn)物的揮發(fā)性成分總離子流色譜圖Fig.6 Total ionization chromatogram of volatile flavor substances in thermal reaction products

        由表5可知,香菇酶解液經(jīng)過熱反應(yīng)后共檢測(cè)出20種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),主要包括含硫化合物3種(72.28%),含氮化合物1種(11.86%),醛類7種(11.51%),醇類4種(2.80%),酯類4種(1.20%),烴類1種(0.35%)。很多研究表明[22-25],含硫化合物是香菇風(fēng)味的重要物質(zhì),其閾值較低,能影響香菇的整體風(fēng)味,本實(shí)驗(yàn)熱反應(yīng)產(chǎn)物中檢測(cè)出1,2,4-三硫雜環(huán)戊烷、1,2,4,5-四硫雜環(huán)己烷、1,2,4,5,7-五硫雜環(huán)辛烷,這些含硫化合物總相對(duì)含量占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),因此對(duì)熱反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味的貢獻(xiàn)最大。但香菇中常見的1,2,3,5,6-五硫雜環(huán)庚烷并未檢測(cè)出,這可能與其受熱不穩(wěn)定易分解有關(guān)。八碳化合物也被認(rèn)為是香菇的重要風(fēng)味物質(zhì),1-辛烯-3-醇、3-辛醇、2-辛烯-1-醇均在本實(shí)驗(yàn)熱反應(yīng)產(chǎn)物中檢測(cè)到,這些化合物具有典型的蘑菇香味,是蘑菇特征香味的重要組成部分。據(jù)報(bào)道[26],熱反應(yīng)能夠引起脂肪酸的降解生成閾值較低的醛類揮發(fā)性化合物,熱反應(yīng)產(chǎn)物中檢測(cè)出相對(duì)含量較高的醛類化合物,與這一研究報(bào)道相符合。此外,熱反應(yīng)產(chǎn)物中還檢測(cè)到含氮化合物、酯類、烴類等,這些化合物對(duì)產(chǎn)物的整體香氣有協(xié)調(diào)和互補(bǔ)的作用。所有這些揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共同構(gòu)成熱反應(yīng)產(chǎn)物香菇菇精的特殊風(fēng)味。

        表5 熱反應(yīng)產(chǎn)物中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)GC-MS分析結(jié)果Table 5 Analysis results of volatile flavor substances in thermal reaction products by GC-MS

        3 結(jié)論

        本試驗(yàn)利用熱反應(yīng)制備香菇菇精,通過單因素和正交試驗(yàn)對(duì)熱反應(yīng)工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化,確定了菇精的熱反應(yīng)最佳工藝為香菇酶解液40 g,木糖0.6 g,半胱氨酸0.1 g,反應(yīng)溫度100 ℃,反應(yīng)時(shí)間1.5 h,pH值為7。在此優(yōu)化條件下,所得的菇精香菇味濃厚、焦香味突出、無糊味且整體香氣協(xié)調(diào)。采用固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)所制備的香菇菇精中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析,共檢測(cè)出20種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),包括含硫化合物(72.28%),醛類7種(11.51%),醇類(2.80%),酯類(1.20%)等,其中含硫化合物總相對(duì)含量占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),對(duì)香菇精風(fēng)味貢獻(xiàn)最大;具有蘑菇特征香味的八碳化合物類在熱反應(yīng)產(chǎn)物中均存在。所有這些揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共同構(gòu)成熱反應(yīng)香菇菇精的特殊風(fēng)味。

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