劉麗娜,魏書信,王安建,田廣瑞,高帥平,邢彩云
(1.河南省農業(yè)科學院 農副產品加工研究中心,河南 鄭州 450002;2.河南農業(yè)大學 食品科學技術學院,河南 鄭州 450002)
香菇(Lentinus edodes)是我國特產食用菌,也是食用菌中最具有代表性的品種之一,不僅肉質肥厚脆嫩,滋味鮮美,香氣獨特,而且具有很高的營養(yǎng)、藥用和保健價值[1],深受人們的喜愛。據中國食用菌協會統計,2017年我國香菇產量986.51萬t,占全國食用菌總產量的26%以上,是產量最大的食用菌品種。近年來,隨著人們生活水平的不斷提高,香菇國際國內市場日益擴大,香菇加工開始向多元化方向發(fā)展,對香菇產品的開發(fā)已有很多研究報道[2-7],如香菇面包、香菇餅干、香菇保健茶、香菇酥糖、香菇熱狗腸、香菇醬等。由于香菇含有豐富的呈味物質,獨特的鮮美滋味使其深加工成為調味料開發(fā)的重要方向。目前在調味料上還是以粗加工為主,工藝簡單,香菇的鮮味和滋味物質釋放不完全,特征香氣不明顯,因此有必要研究開發(fā)一種香菇深加工風味產品。
熱反應技術是改進食品風味和制取新型風味物質的重要手段,廣泛應用于香精領域,利用各種不同糖類和氨基酸化合物的熱反應能產生各種不同的風味物質[8-9],熱反應的程度和系統中的組分、溫度、時間以及pH值等條件有關[10]。各種深入研究發(fā)現采用合適的天然原料,如水解動物蛋白、水解植物蛋白等代替氨基酸來制備香精,可以使得產品的風味更佳飽滿逼真[11]。目前,國內外對香菇的研究主要集中在栽培技術、干制加工、功能成分提取及活性研究等,對干香菇的揮發(fā)性香味成分分析研究的也較多,而對其熱反應香精的風味研究鮮見報道,香菇中氨基酸豐富,含有構成蛋白質的20種氨基酸中的18種,且含有豐富的糖類,這些都是制備熱反應香精的風味前提物質。因此,本研究選用香菇酶解液為原料,添加外源氨基酸和還原糖進行熱反應,制備一款具有菌菇風味、能增香增鮮的新型食品調味料,以期為香菇的精深加工提供一條新途徑。
香菇:購自西峽縣孫氏菌業(yè)專業(yè)合作社,烘干后粉碎過80目篩,取篩下物密封保存?zhèn)溆?;中性蛋白酶(酶?.8AU/g):諾維信投資有限公司;氫氧化鈉、木糖、L-半胱氨酸(均為分析純):國藥集團化學試劑有限公司;濃鹽酸(分析純):煙臺市雙雙化工有限公司。
ZX-9140MBE數顯鼓風干燥箱、SHZ-B水浴恒溫振蕩器:上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;XB-20B多功能粉碎機:上海兆申科技有限公司;FA2004C分析天平:上海越平科學儀器有限公司;超聲波細胞破碎儀:上海汗諾軒儀器有限公司;HC-3018高速冷凍離心機:安徽中科中加科學儀器有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器:河南省予華儀器有限公司;FE20 pH計:梅特勒-托利多儀器上海有限公司;UV-1800型紫外可見分光光度計:濟南海能儀器股份有限公司;MJ-78A高壓滅菌鍋:施都凱儀器設備上海有限公司;Advanced-Ⅰ艾柯超純水機:臺灣艾柯成都康寧實驗專用純水設備廠;Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)儀:美國Agilent公司;固相微萃取手柄、50 μmDVB/CAR/PDMS萃取頭:美國Supelco公司。
1.3.1 香菇酶解液的制備
取適量香菇粉,按照料液比1∶15(g∶mL)加去離子水混合均勻,超聲細胞破碎儀作用10 min(超聲功率800W、頻率20 kHz),添加0.7%中性蛋白酶在50 ℃酶解3 h后,沸水浴滅酶10 min,冷卻,4 000 r/min離心20 min,取上清液即為酶解液(其水解度為18.36%)。
1.3.2 熱反應制備菇精的試驗
(1)熱反應原料的確定
稱取香菇酶解液40 g,分別加入不同含量木糖(0.2 g、0.4 g、0.6 g、0.8 g、1.0 g)、不同含量半胱氨酸(0.05 g、0.10 g、0.15 g、0.20 g、0.25 g),在100 ℃反應2 h,考察熱反應原料對熱反應的影響,通過感官評分和熱反應中間產物A280nm值來確定熱反應原料的添加量。
(2)熱反應條件優(yōu)化單因素試驗
稱取香菇酶解液40 g,添加木糖0.6 g和半胱氨酸0.1 g,考察不同反應溫度(80 ℃、90 ℃、100 ℃、110 ℃、120 ℃),不同反應時間(0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h),不同反應pH值(5、6、7、8、9)對熱反應的影響,通過感官評分和熱反應中間產物A280nm值來確定熱反應條件。
(3)熱反應條件優(yōu)化正交試驗
表1 熱反應條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for thermal reaction conditions optimization
在單因素試驗的基礎上,以感官評分為評價指標,選擇反應溫度、反應時間、反應pH值3個因素進行正交試驗,對熱反應條件參數進行優(yōu)化。正交試驗因素與水平設計見表1。
1.3.3 分析檢測
(1)熱反應中間產物的檢測[12]
熱反應產物中的低分子質量香味中間體可以用280 nm波長處紫外吸光度值表示,吸光度值越大,香味物質越多。將熱反應產物稀釋100倍,以蒸餾水作為參比溶液,在280 nm波長處測定吸光度值。
(2)熱反應產物的感官評價[13]
由五位有感官評定經驗的評定人員從焦香味、糊味、香菇特征香氣、整體香氣4個方面對熱反應產物進行感官評定。焦香味、糊味、香菇特征香氣和整體香氣所占的權重分別是20%、20%、30%和30%,感官評分取加權平均數,總分9分。熱反應產物感官評分標準見表2。
表2 熱反應產物感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of thermal reaction products
(3)氣質聯用分析[14]
固相微萃?。╯olid-phase microextraction,SPME)條件:取10 mL樣液放入40 mL萃取瓶中,蓋上瓶蓋在60 ℃水浴攪拌中平衡20 min后,用萃取頭吸附30 min,然后將萃取頭插入氣質聯用儀的進樣器中解吸5 min。
氣相色譜條件:采用HP-5MS毛細色譜柱(30m×0.25mm×0.25 μm),載氣氦氣(He),流速1 mL/min,不分流,進樣口溫度230 ℃;程序升溫起始溫度35 ℃,保持5 min,5 ℃/min升溫至150 ℃,再以10 ℃/min的速率升至220 ℃,保持2 min,檢測器溫度:280 ℃。質譜條件:電離方式為電子電離(electronic ionization,EI)源,電子能量為70 eV,離子源溫度為230 ℃,四極桿溫度150 ℃,質譜接口溫度250 ℃,質量掃描范圍30~550m/z。
2.1.1 木糖添加量的確定
還原糖是熱反應中重要的反應物質,木糖價廉易得,反應活性好,是呋喃類物質產生的良好前體物,還能促進焦香味和甜味產物產生[15-16]。由圖1可知,在40 g香菇酶解液中,隨著木糖添加量的增加熱反應中間產物A280nm值逐漸增加并趨于平緩,說明木糖增加使熱反應程度增大并產生更多的風味物質。熱反應產物的感官評分隨木糖添加量的增加不斷升高,但木糖添加量為0.7 g時感官評分反而低于0.6 g時,這可能是由于木糖添加量過多,發(fā)生過度焦糖化反應,導致產物產生焦糊味使感官評分降低。綜合考慮木糖的最適添加量為0.6 g。
圖1 木糖添加量對熱反應的影響Fig.1 Effect of xylose addition on thermal reaction
2.1.2 半胱氨酸添加量的確定
圖2 半胱氨酸添加量對熱反應的影響Fig.2 Effect of cysteine addition on thermal reaction
香菇中蛋白質含量很高,且氨基酸種類豐富[17],酶解后是一種理想的熱反應原料。不同的氨基酸在熱反應中會產生不同的風味,在香菇酶解液中添加一定量的半胱氨酸,有助于形成更多的香味物質[18]。由圖2可知,在40 g香菇酶解液中,隨著半胱氨酸添加量的不斷增加,熱反應中間產物A280nm值和熱反應產物的感官評分均呈先上升后下降的趨勢,二者變化趨勢相似,半胱氨酸添加量為0.1 g時A280nm值和感官評分最高。半胱氨酸添加量太多會造成熱反應產物產生硫味,使感官評分降低。因此,半胱氨酸添加量選擇0.1 g。
2.2.1 反應溫度對熱反應的影響
在初始pH值為6的條件下反應2 h,溫度對熱反應的影響見圖3。由圖3可知,反應溫度較低時,熱反應較為緩慢,此時,熱反應中間產物A280nm值和熱反應產物的感官評分都處于較低水平;隨著溫度的升高,反應底物活性增加,熱反應進程不斷加速,溫度每升高10 ℃,反應速率增加3~5倍,熱反應產物增加,因此,熱反應中間產物A280nm值升高趨勢加快,熱反應產物的感官評分逐漸增加;但反應溫度過高熱反應產物會產生焦味和異味,致使熱反應產物的感官評分下降明顯。因此,最適的反應溫度為100 ℃,這與張書香等[19]研究結果相一致。
圖3 反應溫度對熱反應的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on thermal reaction
2.2.2 反應時間對熱反應的影響
圖4 反應時間對熱反應的影響Fig.4 Effect of reaction time on thermal reaction
在反應溫度100 ℃、初始pH值為6的條件下,反應時間對熱反應的影響見圖4。由圖4可知,反應時間較短時,熱反應發(fā)生不完全,產物生成較少,隨著反應時間的延長,熱反應發(fā)生充分,產物含量增加,因此,熱反應中間產物A280nm值和熱反應產物的感官評分逐漸增加;但時間延長到2 h后,會出現焦糊味影響熱反應液的可接受性,從而引起感官評分降低。因此,反應時間選擇2 h為宜。
2.2.3 反應pH值對熱反應的影響
在反應溫度100 ℃、時間2 h的條件下,采用不同反應pH值進行熱反應,結果見圖5。由圖5可知,不同的起始反應pH值對熱反應產物的風味存在影響[20]。隨著pH值的升高,熱反應中間產物A280nm值不斷增加,這符合熱反應在pH 3~10時隨著pH升高而加劇的一般規(guī)律。熱反應產物的感官評分隨著pH值的升高先升后降,當pH值達到6.0以上時,由于氨基的反應性加強,熱反應速度加快,導致產生不良風味[21](如NH3等)。因此,選擇最適反應pH值為6。
圖5 反應pH值對熱反應的影響Fig.5 Effect of reaction pH value on thermal reaction
根據單因素試驗結果,以感官評分為考察指標,對熱反應溫度、時間、pH值進行3因素3水平正交試驗,結果與分析見表3,方差分析見表4。
表3 熱反應條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for thermal reaction conditions optimization
由表3可知,經極差分析可知,3個因素對感官評分的影響從大到小的順序為A>C>B,即反應溫度影響最大,其次是反應pH值和反應時間。最優(yōu)水平組合為A2B1C3,即反應溫度為100 ℃,反應時間為1.5 h,反應pH值為7。在此優(yōu)化條件下進行3次平行驗證試驗,其反應產物感官評分為8.8。由表4方差分析可知,反應溫度對感官評分影響顯著(P<0.05),而反應時間和反應pH值對感官評分無顯著影響(P>0.05)。
表4 正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal tests results
將所得最優(yōu)組合條件下的熱反應產物經GC-MS分析,熱反應產物的揮發(fā)性成分總離子流色譜圖見圖6,分離鑒定出的揮發(fā)性風味物質組成及相對含量見表5。
圖6 熱反應產物的揮發(fā)性成分總離子流色譜圖Fig.6 Total ionization chromatogram of volatile flavor substances in thermal reaction products
由表5可知,香菇酶解液經過熱反應后共檢測出20種揮發(fā)性風味物質,主要包括含硫化合物3種(72.28%),含氮化合物1種(11.86%),醛類7種(11.51%),醇類4種(2.80%),酯類4種(1.20%),烴類1種(0.35%)。很多研究表明[22-25],含硫化合物是香菇風味的重要物質,其閾值較低,能影響香菇的整體風味,本實驗熱反應產物中檢測出1,2,4-三硫雜環(huán)戊烷、1,2,4,5-四硫雜環(huán)己烷、1,2,4,5,7-五硫雜環(huán)辛烷,這些含硫化合物總相對含量占絕對優(yōu)勢,因此對熱反應產物風味的貢獻最大。但香菇中常見的1,2,3,5,6-五硫雜環(huán)庚烷并未檢測出,這可能與其受熱不穩(wěn)定易分解有關。八碳化合物也被認為是香菇的重要風味物質,1-辛烯-3-醇、3-辛醇、2-辛烯-1-醇均在本實驗熱反應產物中檢測到,這些化合物具有典型的蘑菇香味,是蘑菇特征香味的重要組成部分。據報道[26],熱反應能夠引起脂肪酸的降解生成閾值較低的醛類揮發(fā)性化合物,熱反應產物中檢測出相對含量較高的醛類化合物,與這一研究報道相符合。此外,熱反應產物中還檢測到含氮化合物、酯類、烴類等,這些化合物對產物的整體香氣有協調和互補的作用。所有這些揮發(fā)性風味物質共同構成熱反應產物香菇菇精的特殊風味。
表5 熱反應產物中揮發(fā)性風味物質GC-MS分析結果Table 5 Analysis results of volatile flavor substances in thermal reaction products by GC-MS
本試驗利用熱反應制備香菇菇精,通過單因素和正交試驗對熱反應工藝條件進行了優(yōu)化,確定了菇精的熱反應最佳工藝為香菇酶解液40 g,木糖0.6 g,半胱氨酸0.1 g,反應溫度100 ℃,反應時間1.5 h,pH值為7。在此優(yōu)化條件下,所得的菇精香菇味濃厚、焦香味突出、無糊味且整體香氣協調。采用固相微萃取-氣質聯用技術對所制備的香菇菇精中揮發(fā)性風味物質進行分析,共檢測出20種揮發(fā)性風味物質,包括含硫化合物(72.28%),醛類7種(11.51%),醇類(2.80%),酯類(1.20%)等,其中含硫化合物總相對含量占絕對優(yōu)勢,對香菇精風味貢獻最大;具有蘑菇特征香味的八碳化合物類在熱反應產物中均存在。所有這些揮發(fā)性風味物質共同構成熱反應香菇菇精的特殊風味。