徐萌博 趙天增 楊金華 (南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院普胸外科，河南 南陽 473058)

肺癌發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中均高居首位〔1，2〕，5年生存率低于15%，而且<40歲的低齡肺癌患者也逐漸呈上升趨勢，且預(yù)后較高齡患者差〔3,4〕。

分子靶向藥物可有效地改善非小細胞肺癌(NSCLC)患者預(yù)后〔5〕。研究證實，微小RNA(miRNA)在肺癌組織和細胞中作為腫瘤抑制或促進因子，參與癌細胞的增殖、侵襲、遷移和凋亡等過程〔6〕。miR-185在肺癌細胞中表達下調(diào)，與多個基因作用，參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖和遷移等生物學(xué)過程〔7～9〕。轉(zhuǎn)錄共激活因子(TAZ)是Hippo通路的下游效應(yīng)分子，Hippo通路最早發(fā)現(xiàn)于果蠅中，是一種阻礙細胞生長的抑制性信號通路，主要調(diào)控細胞增殖、器官大小等〔10〕。TAZ在NSCLC組織中呈現(xiàn)高表達，且其表達與患者預(yù)后密切相關(guān)〔11,12〕。miR-185和TAZ在肺癌增殖、遷移和侵襲中都具有重要作用，而兩者在肺癌中是否存在某種調(diào)控關(guān)系，尚不清楚。本研究以NSCLC 細胞H1299為研究對象，研究 miR-185影響H1299細胞增殖、侵襲和遷移的分子機制及TAZ在此機制中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 人肺癌細胞株H1299和人正常肺黏膜上皮細胞株BEAS-2B購自ATCC；胎牛血清(FBS)和DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，牛血清白蛋白(BSA)、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)和胰蛋白酶Trypsin購自Sigma-Aldrich公司；Transwell板購自美國Corning公司；雙熒光素酶報告系統(tǒng)(Dual-Luciferase Reporter Assay System)購自美國Promega公司；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑、Total RNA提取試劑盒、 RT聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司；抗TAZ抗體和β-actin抗體購自Abcam；光學(xué)顯微鏡、全自動酶標儀及RT-PCR儀購自美國Bio-Rad公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒購自Thermo。

1.2細胞培養(yǎng) 用含10% FBS+100 U/ml 青霉素+100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)H1299細胞，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，濕度95%。待細胞生長至對數(shù)生長期時洗滌消化傳代。

1.3細胞轉(zhuǎn)染 培養(yǎng)H1299細胞至對數(shù)生長期，用細胞培養(yǎng)液稀釋細胞濃度至1×106個/ml，200 μl/孔接種于6孔板中，細胞培養(yǎng)至基本融合為一層時按照Lipofectamine2000說明書進行轉(zhuǎn)染。先用無血清OptiMEM培養(yǎng)液稀釋Lipofectamine2000、si-con、si-TAZ、miR-con、miR-185、miR-185+pcDNA、miR-185+pcDNA-TAZ、anti-miR-con、anti-miR-185、野生型(WT)-TAZ+miR-con、WT-TAZ+miR-185、突變型(MUT)-TAZ+miR-con和MUT-TAZ+miR-185的載體，之后取等體積Lipofectamine2000和各組載體混合，輕柔混勻后室溫孵育20 min，將混合液滴入到培養(yǎng)好的細胞孔板中，邊滴加邊輕晃培養(yǎng)板，混勻后置37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h后換成完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.4RT-PCR檢測mRNA的表達 收集轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的各組H1299細胞(miR-con組、miR-185組、anti-miR-con組、anti-miR-185組、si-con組和si-TAZ組)，用試劑盒提取總RNA，測定濃度和純度，保存于-80℃。然后按照反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒說明書合成cDNA，反應(yīng)程序為16℃ 40 min、42℃ 40 min、72℃ 10 min；4℃放置10 min，合成的cDNA測定濃度和純度后置于-80℃保存。取cDNA按照RT-PCR的說明書進行反應(yīng)，反應(yīng)程序為：95℃ 5 min；95℃ 40 s、58℃ 45 s、72℃ 40 s，42個循環(huán)；72℃ 10 min。引 物 如 下：miR-185 上 游： 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，下游： 5′-TGGAGAGAAAGGCAGTTCCTGA-3′；TAZ上游：5′-TGAGAGCCGAAGCCCTTAGA-3′，下游： 5′-GGATTCATCTTCTGGGCGGG-3′。運用IQ5TM RT-PCR Detection System(Bio-Rad)進行數(shù)據(jù)分析。

1.5MTT實驗測定細胞活性 收集轉(zhuǎn)染后的H1299細胞，Trypsin消化細胞后，用培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至1×104個/ml，2×103個/孔(200 μl/孔)接種于96微孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)，分別在24、48、72 h進行 MTT 實驗，每孔加入 20 μl(5 mg/ml)MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，室溫振蕩5 min，酶標儀測定OD490 nm 處的吸光度(A)值。

1.6Transwell實驗測定細胞遷移和侵襲 遷移實驗：轉(zhuǎn)染后的各組H1299細胞(miR-con組、miR-185組、si-con組、si-TAZ組、miR-185+pcDNA組和miR-185+pcDNA-TAZ組)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集細胞加入含1%FBS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)12～24 h，用Trypsin消化細胞，離心收集細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入含10 g/L BSA的DMEM培養(yǎng)基，調(diào)整細胞濃度為2×105個/ml。Transwell下層培養(yǎng)孔加入500 μl 10%FBS培養(yǎng)基作為遷移趨化物，取100 μl細胞加入Transwell上層小室，再將上層小室放入下層培養(yǎng)孔中，培養(yǎng)48 h，取出用棉簽拭去基質(zhì)膠和上層小室的細胞，冰甲醛固定細胞，結(jié)晶紫染色，顯微鏡觀察計數(shù)。

侵襲實驗：從-20℃將基質(zhì)膠取出，置于4℃冰箱融化過夜，以4℃無血清培養(yǎng)基1∶3比例稀釋基質(zhì)膠，加入上層Transwell小室，37℃ 3 h烘干，以下步驟同遷移實驗，上層小室加入100 μl細胞，下層加入500 μl 10%FBS培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，冰甲醛固定細胞，結(jié)晶紫染色，計數(shù)。

1.7雙熒光素酶報告實驗 將轉(zhuǎn)染48 h后的H1299細胞進行胰蛋白酶消化，計數(shù)，以1×104個細胞/孔接種于24孔板中，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察若細胞融合度達到80%～90%，則按照Lipofectamine2000說明書進行轉(zhuǎn)染，分別構(gòu)建WT-TAZ和MUT-TAZ雙熒光素酶報告載體，分別共轉(zhuǎn)染miR-con或miR-185，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，收集細胞，加入配制好的裂解緩沖液，室溫裂解15 min，離心收集上清，-20℃保存或直接檢測。加入熒光素酶底物，發(fā)光儀檢測熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參照，計算相對螢火蟲熒光素酶活性。

1.8Western印跡實驗 將BEAS-2B細胞和轉(zhuǎn)染后的各組H1299細胞(miR-con組、miR-185組、anti-miR-con和anti-miR-185組)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后收集細胞，加入放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液重懸細胞，冰浴超聲破碎細胞，收集蛋白并檢測蛋白濃度。每個樣本取30 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入1 000倍稀釋的一抗TAZ，4℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜2次，然后加入500倍稀釋的二抗，室溫孵育2 h。以β-actin為內(nèi)參照，分析蛋白水平。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-185和TAZ在肺癌H1299細胞和人正常肺上皮細胞BEAS-2B中的表達 與BEAS-2B組相比，在肺癌細胞H1299組中TAZ的表達量顯著升高(P<0.01)，而miR-185的表達量則顯著下降(P<0.001)，見圖1，表1。

圖1 檢測TAZ在肺癌H1299細胞和人正常肺上皮細胞BEAS-2B中的表達

2.2過表達miR-185可抑制肺癌H1299細胞增殖、遷移和侵襲 與miR-con組相比，miR-185組的miR-185表達水平顯著上升(P<0.001)，miR-185組的細胞活性(OD490 nm)在48 h、72 h均顯著下降(P<0.05，P<0.01)，miR-185組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均顯著下降(P<0.001，P<0.01)，見表2。

表1 檢測miR-185和TAZ在H1299和BEAS-2B中的表達

組別miR-185細胞活性(OD490 nm)24 h48 h72 h遷移細胞數(shù)(個)侵襲細胞數(shù)(個)miR-con組0.25±0.040.29±0.040.55±0.070.86±0.09173.50±12.13107.65±12.84miR-185組1.24±0.110.26±0.030.38±0.050.55±0.0665.18±7.4540.58±5.88t/P值14.650/0.0001.039/0.3573.423/0.0274.964/0.00813.180/0.0008.226/0.001

2.3miR-185靶向調(diào)控TAZ的表達 TAZ的3′-UTR序列中含有與miR-185互補的核苷酸序列，見圖2A。與miR-con組相比(0.79±0.09)，miR-185組的TAZ蛋白表達水平均顯著下降(0.19±0.05，P<0.05)；與anti-miR-con組相比(0.74±0.08)，anti-miR-185組的TAZ蛋白表達量均顯著上升(1.55±0.12，P<0.05)，見圖2B。與miR-con組相比，miR-185組WT-TAZ的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著下降(P<0.001)；而MUT-TAZ的螢火蟲熒光素酶相對活性沒有明顯變化。見表3。

圖2 miR-185靶向抑制TAZ 的表達

表3 雙熒光素酶報告實驗

2.4沉默TAZ抑制肺癌H1299細胞增殖、遷移和侵襲 與si-con組相比，si-TAZ組TAZ表達水平顯著下降(P<0.001)，si-TAZ組H1299細胞活性在48、72 h時均顯著降低(P<0.01)，遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)也顯著下降(P<0.01)，見圖3，表4。

圖3 肺癌H1299細胞中TAZ的表達

組別TAZ蛋白細胞活性(OD490 nm)24 h48 h72 h遷移細胞數(shù)(個)侵襲細胞數(shù)(個)si-con組0.78±0.070.32±0.040.58±0.060.84±0.09168.12±12.42102.70±11.05si-TAZ組0.28±0.040.27±0.030.35±0.040.52±0.0669.44±6.2441.40±5.48t/P值10.742/0.0001.732/0.1585.524/0.0055.124/0.00712.297/0.0008.608/0.001

2.5過表達miR-185和過表達TAZ對H1299細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-con組相比，miR-185組48 h和72 h時H1299細胞活性、遷移和侵襲細胞數(shù)均顯著下降(P<0.05)；與miR-185+pcDNA組相比，miR-185+pcDNA-TAZ組H1299細胞活性、遷移和侵襲細胞數(shù)均顯著上升(P<0.05)。見表5。

組別細胞活性(OD490 nm)24 h48 h72 h遷移細胞數(shù)(個)侵襲細胞數(shù)(個)miR-con組0.30±0.040.61±0.070.88±0.09147.56±14.78106.64±11.28miR-185組0.26±0.030.38±0.051)0.59±0.061)67.44±7.241)45.78±5.661)miR-185+pcDNA組0.25±0.030.36±0.040.55±0.0660.12±7.1639.70±4.92miR-185+pcDNA-TAZ組0.29±0.040.53±0.052)0.72±0.072)107.82±12.342)81.40±9.382)F/P值1.360/0.32315.096/0.00113.168/0.00241.322/0.00043.713/0.000

與miR-con組比較：1)P<0.05；與miR-185+pcDNA組比較：2)P<0.05

3 討 論

miR-185首次發(fā)現(xiàn)于人神經(jīng)母細胞瘤〔13〕，在肺癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤組織和細胞中均異常表達，可通過靶向腫瘤相關(guān)基因參與腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等過程〔14〕。miR-185在NSCLC組織和細胞系中表達顯著下調(diào)〔15〕，在肺腺癌細胞系也顯著下調(diào)〔9,16〕，且與腫瘤大小、分期和低總存活率相關(guān)〔15〕。曹燕飛等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-185在肺癌細胞中表達呈現(xiàn)顯著下調(diào)，其通過抑制E2F6表達而抑制肺鱗癌細胞的增殖和侵襲，過表達miR-185可以靶向下調(diào)Six1基因表達調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)途徑從而抑制肺癌細胞的遷移和侵襲能力〔8〕。本研究結(jié)果表明，過表達miR-185則可抑制H1299細胞增殖、遷移和侵襲。

TAZ基因作為Hippo通路的主要成員，具有調(diào)控哺乳動物器官大小的作用〔17〕。研究表明，TAZ在肺癌組織中出現(xiàn)表達上調(diào)，與肺癌細胞的侵襲和遷移有關(guān)〔10,11,18〕。本研究證實，沉默TAZ基因表達則可抑制肺癌H1299細胞增殖、遷移和侵襲。此外，本研究通過Targetscan軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，TAZ的3′-UTR序列中含有與miR-185互補的核苷酸序列，暗示miR-185與TAZ之間可能存在某結(jié)合位點或者某種調(diào)控關(guān)系。Western印跡和雙熒光素酶報告結(jié)果均表明，miR-185反向調(diào)控TAZ的表達，而外源回補TAZ表達則會逆轉(zhuǎn)過表達miR-185對H1299細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。兩者的關(guān)系在胰腺癌中也被研究，Xia等〔19〕發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌患者樣本(包括癌組織、胰液和血清)中，TAZ表達水平上調(diào)，miR-185和TAZ的表達呈負相關(guān)，沉默TAZ和過表達miR-185均可抑制胰腺癌組織的增殖，miR-185通過靶向TAZ調(diào)控胰腺癌組織的增殖。而本研究結(jié)果與Xia等〔19〕研究結(jié)果類似，在NSCLC中，過表達miR-185和沉默TAZ基因均可抑制H1299細胞增殖、遷移和侵襲，miR-185通過靶向TAZ調(diào)控肺癌組織的增殖、遷移和侵襲。miR-185有望成為肺癌診斷和治療新的靶標，對肺癌的診斷和治療具有重要的指導(dǎo)意義。