陳樂彤 劉江惠 劉亮 王靜 徐志彬

(河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院 1腫瘤研究所，河北 石家莊 050011；2內(nèi)鏡科)

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，居消化道惡性腫瘤發(fā)病率第一位，且病死率高〔1，2〕，目前，手術(shù)、化療及放療仍是胃癌的常規(guī)治療方法。手術(shù)是胃癌的首選治療方法，但在目前，較多的胃癌患者初診時已是中晚期，無法進行手術(shù)治療，對于這些患者，化療就成為其最主要的治療方法之一，但是由于化療藥物的高毒副作用及多藥耐藥性，往往影響化療的療效，甚至導致化療失敗。因此，尋找高效、低毒的抗胃癌藥，可有效地提高胃癌患者治療效果，延長患者生存期。在中國利用中草藥進行腫瘤治療已具有悠久歷史，且其具有低毒、高效、價廉等優(yōu)點。青蒿琥酯(Art)是青蒿素的一種衍生物，主要來源于植物黃花蒿。Art是高效低毒的抗瘧疾藥物，且在耐藥及重型瘧疾治療上具有較大的優(yōu)勢，治療效果較佳〔3～5〕，隨著對Art的進一步深入研究，發(fā)現(xiàn)，Art除了具有抗瘧疾作用以外，其還具有抑制腫瘤細胞生長等作用〔6～9〕。已有大量文獻報道，Art對多種腫瘤細胞具有生長抑制及誘導細胞凋亡作用〔10，11〕，但在胃癌細胞中的研究較少，且具體機制尚未闡明。本文主要利用細胞實驗，通過Art干預胃癌SGC-7901細胞生長，研究Art是否具有抑制胃癌細胞生長作用，并進一步探討其抑制胃癌細胞生長作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 Annexin V-FITC/PI雙染凋亡檢測試劑盒，美國Beckman Coulter公司；Art，中國桂林南藥股份有限公司；小鼠抗人B細胞淋巴瘤(Bcl)-2及B細胞淋巴瘤2相關(guān)蛋白(Bax)抗體，美國Santa Cruz公司；兔抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3抗體，中國北京中杉金橋公司；若丹明(Rho)123，中國北京索萊寶科技有限公司；人胃癌細胞株SGC-7901，中國中科院上海細胞庫。FC500型流式細胞儀，美國Beckman Coulter公司。

1.2方法

1.2.1Art干預SGC-7901細胞實驗分組 收集處于對數(shù)生長期的胃癌SGC-7901細胞，調(diào)整細胞濃度為5×106/ml，將1 ml細胞懸液接種至細胞培養(yǎng)瓶，帶細胞貼壁后，且細胞融合度達到80%左右，細胞處于對數(shù)生長期，加入不同濃度Art，使藥物終濃度分別達到30、60、120 μmol/L，生理鹽水代替Art作為對照組。Art干預細胞24 h，收集細胞，冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次，調(diào)整細胞濃度為1×106/ml。每組實驗重復3次。

1.2.2Art干預SGC-7901細胞后細胞凋亡檢測 取上述制備的單細胞懸液1 ml，含1×106細胞。利用冷PBS洗細胞1次，去除上清液，冷1×結(jié)合緩沖液100 μl 懸浮細胞，加入Annexin V-FITC 試劑10 μl，4℃避光放置15 min，而后加入1×結(jié)合緩沖液380 μl，隨后加入碘化丙啶(PI)染液10 μl 4℃避光放置15 min，冷PBS洗滌細胞1次，1ml PBS懸浮細胞后，利用流式細胞儀進行檢測。

1.2.3Art干預SGC-7901細胞后細胞中Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白檢測 取上述制備的單細胞懸液1 ml，含1×106細胞，冷PBS洗滌細胞1次，PBS 100 μl懸浮細胞，放入流式細胞儀上樣管中，設(shè)置3個平行管。分別向其中加入小鼠抗人Bcl-2、Bax及兔抗人Caspase-3抗體100 μl，室溫放置30 min，而后PBS洗滌細胞1次(1 000 r/min，5 min)，去除上清液后，100 μl PBS液懸浮細胞，分別向每管中加入羊抗小鼠及羊抗兔IgG-FITC熒光二抗，室溫避光放置30 min，PBS洗滌細胞1次(1 000 r/min，5 min)，去除上清液后，1 ml PBS液懸浮細胞，300目尼龍網(wǎng)過濾后，流式細胞儀檢測細胞。同時設(shè)置只加IgG-FITC二抗不加一抗的同型對照組。以平均熒光強度表示蛋白表達量。

1.2.4Art干預SGC-7901細胞后細胞線粒體膜電位檢測 取上述制備的單細胞懸液1 ml，含1×106細胞，冷PBS洗滌細胞1次，PBS 100 μl懸浮細胞，放入流式細胞儀上樣管中，向上樣管加入Rho 123染料，使終濃度達到10 μg/ml，37℃ 下避光放置30 min，PBS洗滌細胞1次后，1 ml PBS懸浮細胞，300目尼龍網(wǎng)過濾后，流式細胞儀檢測細胞。流式細胞術(shù)檢測細胞線粒體膜電位水平以平均熒光強度表示。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS11.5軟件進行方差分析，LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1Art誘導胃癌SGC-7901細胞凋亡 30、60、120 μmol/L Art干預胃癌SGC-7901細胞24 h，細胞凋亡率分別為〔(5.48±0.67)%、(12.55±1.17)%、(23.43±2.18)%〕顯著高于對照組〔(0.87±0.14)%,P<0.05〕；120 μmol/L Art組細胞凋亡率顯著高于30及60 μmol/L Art組(P<0.05)，見圖1。

圖1 青蒿琥酯作用SGC-7901細胞24 h后細胞凋亡

2.2Art下調(diào)SGC-7901細胞中Bcl-2蛋白表達、上調(diào)細胞中Bax蛋白表達 30、60、120 μmol/L Art組SGC-7901細胞中Bcl-2及Bax蛋白表達水平分別為(435.79±7.10、397.76±10.28、362.76±8.74) 及(316.77±5.93、352.40±5.96、388.56±9.30)；對照組中Bcl-2及Bax蛋白表達水平為(466.81±10.18、291.00±8.95)。青蒿琥酯組中Bcl-2蛋白表達量顯著低于對照組(P<0.05)，而Bax蛋白表達量顯著高于對照組(P<0.05)。且具有Art劑量依賴性。

2.3Art下調(diào)SGC-7901細胞線粒體膜電位表達水平 30、60、120 μmol/L Art組SGC-7901細胞線粒體膜電位表達水平(489.34±3.49、473.19±3.01、442.54±4.59)顯著低于對照組(500.80±2.65)，(P<0.05)，且具有劑量依賴性。

2.4Art上調(diào)SGC-7901細胞中Caspase-3蛋白表達水平 30、60、120 μmol/L Art組SGC-7901細胞中Caspase-3蛋白表達水平(363.44±7.46、391.90±4.32、426.34±4.08)顯著高于對照組(335.82±8.16，P<0.05)，且具有劑量依賴性。

3 討 論

胃癌是發(fā)病率較高的消化道惡性腫瘤〔12〕，且病死率高〔13〕，手術(shù)、放療及化療等是胃癌的常規(guī)治療方法。胃癌發(fā)病過程隱匿，一般患者就診時已是中晚期，錯過手術(shù)的最佳時機，化療就成為其主要的治療方法之一。影響化療效果的最主要因素包括，化療藥物的高毒副作用及化療藥物的多藥耐藥〔14〕。

本課題小組在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，Art具有抑制食管癌細胞生長的作用，并初步探究了其作用機制與誘導細胞周期阻滯及細胞凋亡有關(guān)。文獻顯示，Art對多種腫瘤細胞具有生長抑制作用〔7〕，但目前在胃癌中的相關(guān)研究少有報道，且作用機制尚未闡明。

細胞凋亡調(diào)控的穩(wěn)態(tài)對于維持正常組織的功能具有重要意義，一旦平衡被打破，就會引起疾病發(fā)生，包括腫瘤的發(fā)生。腫瘤細胞在其發(fā)生及發(fā)展過程中，細胞凋亡機制往往被抑制，導致腫瘤細胞的旺盛增殖能力。鑒于凋亡與腫瘤發(fā)生有如此密切關(guān)系，目前開發(fā)新抗癌藥物時，將藥物能否誘導腫瘤細胞凋亡作為判斷藥物是否有效的重要評價指標。

實驗中觀測到青蒿琥酯干預SGC-7901細胞后，出現(xiàn)細胞凋亡，且隨著青蒿琥酯濃度的增加，誘導細胞凋亡作用越強。提示了青蒿琥酯具有誘導胃癌細胞凋亡作用。這與本課題組以往研究的青蒿琥酯具有誘導食管癌細胞凋亡作用〔15,16〕相一致。

線粒體是細胞生命活動控制中心，是細胞凋亡重要調(diào)控中心。細胞線粒體的跨膜電位降低可以誘導細胞色素C等釋放，活化Caspase 蛋白酶家族，引起細胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)，使細胞進入不可逆的凋亡過程。Bcl-2可以穩(wěn)定細胞線粒體膜電位，防止線粒體膜電位的耗散，起到抑制細胞凋亡的作用。而Bax則可導致線粒體膜電位的耗散，從而促進細胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，Art可以降低細胞線粒體膜電位水平。同時也檢測到Art可以抑制SGC-7901細胞中Bcl-2蛋白表達，上調(diào)Bax及Caspase-3蛋白的表達。提示，Art可以通過線粒體途徑誘導細胞凋亡。