李超紅 劉玉珍 (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 河南省神經(jīng)修復(fù)重點實驗室，河南 衛(wèi)輝 453100)

頸動脈體(CB)是由來源于神經(jīng)脊的Ⅰ型細胞和類似神經(jīng)膠質(zhì)細胞的Ⅱ型支持細胞組成的位于CB分叉處的外周化學(xué)感受器，它能感受流經(jīng)它的動脈血中的氧分壓(PO2)、二氧化碳分壓(PCO2)、pH的變化，通過竇神經(jīng)將化學(xué)信號轉(zhuǎn)化為電信號傳入中樞，導(dǎo)致呼吸和心血管系統(tǒng)改變〔1，2〕。由于CB體積微小(大鼠3×106μm3)并含有豐富的血管網(wǎng)，目前針對CB的研究手段比較局限，且由于細胞培養(yǎng)困難且獲得的細胞數(shù)目有限，故很多實驗室關(guān)于CB的研究很少能達到細胞水平。其中國外常用的CB細胞培養(yǎng)一般多來源于幼年期(0～8周齡)動物的CB〔3，4〕，應(yīng)用含有多種生長因子的特殊培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，費用昂貴且失敗率較高。前期我們對成年(8～10周齡)大鼠的CB完整組織進行常規(guī)培養(yǎng)，成功培養(yǎng)出有活性的CB組織，并可用于后續(xù)實驗〔5〕。本研究在上述CB組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上探討通過常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)成年8～9周齡大鼠CB原代細胞的方法，觀察常規(guī)培養(yǎng)條件下，成年大鼠CB細胞是否可以存活。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級成年Sprague-Dawley(SD)大鼠，雄性，8～9周齡，250～270 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供(No.11400700368268)。

1.1.2主要試劑 兔抗酪氨酸羥化酶抗體(TH)和兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)抗體購自abcam公司；小鼠抗巢蛋白(Nestin)抗體、兔抗β-actin抗體、抗兔Alexa Fluor?555標(biāo)記熒光二抗、抗兔Alexa Fluor?488標(biāo)記熒光二抗和抗小鼠Alexa Fluor?555標(biāo)記熒光二抗均購自CST公司；胰蛋白酶和小鼠抗TH抗體購自Sigma公司；膠原酶Ⅳ和胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購自Invitrogen公司；脫氧核糖核酸酶購自Worthington公司；胰島素購自碧云天公司；DMEM/F-12(1∶1)購自Thermo公司；青鏈霉素混合液(雙抗)和磷酸鹽緩沖液(PBS)購自Solarbio公司；多聚-D-賴氨酸(PDL)購自博士德公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3主要儀器 XYH-4A體視顯微鏡購自上海光學(xué)儀器一廠；3111二氧化碳培養(yǎng)箱購自Thermo公司；CL31R低溫超速離心機購自Thermo公司。

1.1.4主要溶液配制 ①CB細胞生長培養(yǎng)基：DMEM/F-12(1∶1)，10% FBS，1×青鏈霉素混合液，胰島素80 U/L混合備用。②膠原酶緩沖液：膠原酶Ⅳ 500 μg/ml，胰蛋白酶 500 μg/ml，脫氧核糖核酸酶50 μg/ml，1×青鏈霉素混合液。所有試劑均為無菌溶液。

1.2方法

1.2.1準(zhǔn)備工作 ①PDL包被無菌玻片將5 mg/ml PDL用無菌PBS稀釋成100 μg/ml，將10 mm玻片置于24孔板中，于每個玻片上滴加100 μg/ml PDL并完全覆蓋玻片，37℃過夜孵育。之后無菌PBS洗滌玻片2次，超凈工作臺干燥1 h。②CB細胞生長培養(yǎng)基1 ml提前1 d置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱預(yù)溫并飽和氧，分離當(dāng)天提前放于冰上預(yù)冷。

1.2.2游離CB 體重250～270 g、8～9周齡健康雄性SD大鼠2只，10%水合氯醛(0.34 ml/0.1 kg)腹腔注射麻醉，斷頭后將頭部置于冰上，游離雙側(cè)頸總動脈分叉，放于預(yù)冷并持續(xù)充罐95%O2-5%CO2混合氣的PBS中，體視鏡下小心去除CB周圍多余結(jié)締組織及神經(jīng)節(jié)等，完全游離CB，10%雙抗洗滌并放于預(yù)冷的CB細胞生長培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱復(fù)溫10 min。

1.2.3CB細胞消化分離 復(fù)溫后，將CB移至含有100 μl膠原酶緩沖液的1.5 ml離心管，采用37℃培養(yǎng)箱孵育消化8 min，20 ml注射器針頭斜面從CB中心對半切割CB的方法，重復(fù)3次直到肉眼看不到完整組織塊，離心管中為絲狀物或碎片狀后，輕微吹打數(shù)次后加入100 μl CB生長培養(yǎng)基，1 000 r/min離心5 min后，吸取上清種于一個包被PDL的玻片上，沉淀用150 μl CB生長培養(yǎng)基重懸后，種于2個PDL包被的玻片上，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱過夜孵育讓其貼壁，次日加入200 μl CB生長培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并進行后續(xù)染色。

1.2.4免疫熒光化學(xué)染色 將貼有CB細胞的玻片用PBS洗滌2次后，4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗滌5 min ×3次后；0.2% TritonX-100通透7 min，PBS洗滌5 min × 3次；10%山羊血清室溫封閉1 h；之后過夜孵育下述一抗或一抗混合液：兔抗TH-1∶100，兔抗TH-1∶100混合鼠抗Nestin-1∶200，鼠抗TH-1∶1 000混合兔抗GFAP-1∶100。PBS洗滌后，室溫避光孵育熒光標(biāo)記二抗1 h，即抗兔Alexa Fluor?555標(biāo)記熒光二抗，抗兔Alexa Fluor?488標(biāo)記熒光二抗和抗小鼠Alexa Fluor?555標(biāo)記熒光二抗。PBS洗滌后，DAPI標(biāo)記細胞核并封片。Axio Observer A1倒置熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果，并用AxioCam MRc5照相機拍照。

2 結(jié) 果

2.1成年大鼠CB原代培養(yǎng)細胞 在常規(guī)細胞培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)成年大鼠CB原代細胞1 d后，于倒置顯微鏡下觀察，如圖1所示，玻片上可見到少許散在分布的細胞，形狀不一，有些細胞成團生長，呈立體團簇狀(如圖1C～F)；而有些細胞成細長桿狀，一端或兩端膨大，散在單個生長(如圖1A，B)。

2.2CBⅠ型細胞和Ⅱ型細胞鑒定 CB主要由感受氧的Ⅰ型細胞，類似神經(jīng)膠質(zhì)細胞的Ⅱ細胞，毛細血管，結(jié)締組織和神經(jīng)纖維所組成。為進一步確定所培養(yǎng)原代細胞的類型，我們采用Ⅰ型細胞標(biāo)記物TH來鑒定Ⅰ型細胞。如圖2所示，呈團簇狀生長的細胞顯示TH免疫反應(yīng)陽性，說明該類細胞為典型的CBⅠ型細胞，這也與Ⅰ型細胞成簇狀排列生長的特性相符合。應(yīng)用Ⅱ細胞標(biāo)記物GFAP來鑒定Ⅱ型細胞，如圖3所示，細長纖維狀且一端膨大或呈扁平狀的細胞顯示GFAP免疫反應(yīng)陽性，說明該類細胞為與膠質(zhì)細胞類似的Ⅱ型細胞。

2.3成年大鼠CB原代培養(yǎng)細胞Nestin染色 CB細胞繼續(xù)培養(yǎng)4 d后，應(yīng)用雙熒光標(biāo)記，觀察成年大鼠普通培養(yǎng)基條件下，CB原代培養(yǎng)細胞中Nestin的表達情況。如圖4所示，紅色標(biāo)記的Nestin主要位于綠色標(biāo)記的TH周圍。說明，成年大鼠在普通培養(yǎng)基條件下亦有部分具有Nestin+干細胞特性，且可分化出TH陽性Ⅰ型細胞。

2.4類膠質(zhì)細胞中TH染色陽性 此外，本研究還借助β-actin觀察扁平多邊形類膠質(zhì)細胞骨架，發(fā)現(xiàn)，該類型細胞中亦有TH免疫染色。推測這種細胞可能介于Ⅱ型細胞和干細胞特性之間，部分轉(zhuǎn)化為Ⅰ型細胞。見圖5。

A1～C1：TH(紅色)和DAPI(藍色)merge后的CBⅠ型細胞，A2，B2：A1，B1對應(yīng)的Ⅰ型細胞TH染色，C2：白光下的C1圖2 TH陽性Ⅰ型細胞(DAPI,Bar=20 μm)

圖3 GFAP陽性Ⅱ型細胞(Bar=10 μm)

圖4 大鼠CB細胞 Nestin和TH共定位染色(Bar=20 μm)

圖5 大鼠CB細胞中TH和β-actin共定位染色(Bar=20 μm)

3 討 論

本研究以成年8～9周齡大鼠CB為對象，采用酶加機械分離方法，在常規(guī)培養(yǎng)條件下成功培養(yǎng)出CB細胞，且發(fā)現(xiàn)成年大鼠CB細胞中含有Nestin+干細胞，這種細胞可能有利于CB的低氧應(yīng)答。

CB是體內(nèi)重要的外周化學(xué)感受器〔6〕，由于其體積微小，針對其的研究方案比較局限，且多針對新生或者幼齡動物。CB對氧極其敏感，導(dǎo)致離體后的CB極易失活，CB原代細胞培養(yǎng)困難，成功率較低；且由于培養(yǎng)基成分特殊及多種細胞因子，導(dǎo)致原代培養(yǎng)的費用比較昂貴。成年大鼠對氧更為敏感，CB本身耗氧量也較幼年增加，針對成年大鼠的CB細胞原代培養(yǎng)少見報道。

2017年，來自塞維利亞大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究所的Annese等〔7〕用成年轉(zhuǎn)基因小鼠及6周齡的大鼠培養(yǎng)CB取得成功，并發(fā)現(xiàn)CB細胞中含有干細胞，但這種培養(yǎng)需要5種特殊生長因子，費用昂貴，且大鼠為6周齡幼年大鼠。對于一些僅需要簡單定性定位或者短時間處理的研究來說，該培養(yǎng)方法費用較高，且一旦培養(yǎng)過程中出現(xiàn)污染，造成的浪費也較大。因此尋找一種價格低廉，能夠保持CBⅠ型細胞簇狀生長特性且針對成年大鼠的CB原代培養(yǎng)方法是有必要的。而本研究正是以此為出發(fā)點，成功尋找一種針對成年大鼠的有效的、不需借助細胞因子的CB原代培養(yǎng)方法，該方法可以用于后期CB細胞水平研究。

CBⅠ型細胞來源于胚胎時期的神經(jīng)脊，是CB的主要氧感受細胞〔8〕，其胞質(zhì)內(nèi)含有大量神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)質(zhì)〔9〕，低氧時通過釋放這些神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)質(zhì)，興奮與其形成突觸的竇神經(jīng)末梢，從而將信號傳入中樞神經(jīng)系統(tǒng)〔10〕。而CBⅡ型細胞是一種類似神經(jīng)膠質(zhì)細胞的支持細胞〔11〕，它支撐營養(yǎng)Ⅰ型細胞。在完整CB組織中，通過蘇木素-伊紅(HE)染色，可見到CBⅠ型細胞成簇狀排列，單個CB中可見到很多團簇狀的Ⅰ型細胞團，簇狀細胞團之間含有豐富的毛細血管和結(jié)締組織。進一步采用免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，在簇狀排列的I型細胞周圍圍繞著GFAP陽性Ⅱ型細胞和神經(jīng)末梢，這種排列方式，有利于不同細胞間通過旁分泌或自分泌途徑相互作用，更好地傳遞化學(xué)信號，這種特性也決定了體外培養(yǎng)的CB需要模擬體內(nèi)環(huán)境的生長方式才能更好的從細胞水平研究其低氧應(yīng)答機制。在培養(yǎng)CB細胞過程中，通過20 ml注射器針頭斜面對半切割CB可從一定程度上減少無規(guī)律或任意撕扯造成單個細胞過多的情況，采用借助Ⅰ型和Ⅱ型細胞標(biāo)志物，檢測所培養(yǎng)的CB細胞中，簇狀生長的為Ⅰ型細胞，細長桿狀或扁平狀的為Ⅱ型細胞，符合體內(nèi)CB的細胞生長特性，可以進行后續(xù)細胞水平研究。

前期關(guān)于CB的多個研究認(rèn)為〔7，12，13〕，CBⅡ型細胞在低氧條件下，可失去自身GFAP陽性染色，轉(zhuǎn)變?yōu)镹estin+的干細胞，表現(xiàn)為干細胞特性，且隨著低氧時間延長，幾乎看不到Ⅱ型細胞的GFAP染色，Nestin染色反而增強或者轉(zhuǎn)變?yōu)棰裥图毎龆?。此外，在上述關(guān)于CB干細胞的研究中，Nestin+細胞多表現(xiàn)為圓形球狀，其周邊成芽狀小突起呈TH染色陽性；但也可見扁平多邊形類膠質(zhì)狀細胞Nestin染色陽性。而在本實驗中，培養(yǎng)4 d后，成年大鼠CB細胞中可見Nestin+的干細胞，這種細胞中可見較弱的TH染色陽性，推測這種改變可能是由于隨著培養(yǎng)時間延長，細胞數(shù)目增多，由于細胞代謝及細胞呼吸，常規(guī)培養(yǎng)基處于一種低營養(yǎng)環(huán)境，刺激了Ⅱ型細胞干細胞分化為TH細胞。這種現(xiàn)象也說明這種培養(yǎng)方法可以用于后續(xù)短期內(nèi)Ⅱ型細胞與Ⅰ型細胞間的轉(zhuǎn)化研究或關(guān)于Ⅱ型細胞干細胞特性的研究。

此外，在CB細胞原代培養(yǎng)過程中，由于Ⅱ型細胞的干細胞特性，TH陽性反應(yīng)不僅見于成團簇狀生長的Ⅰ型細胞中，還可見于多邊形扁平的類膠質(zhì)細胞中。綜上，本研究所建立的成年大鼠CB細胞原代培養(yǎng)方法，為深入探討CB細胞水平機制提供了一種價格低廉，經(jīng)濟實用的研究方案。