闕祖亮，龐丹清，陳 勇?，陳子雋，李金洲，魏江存

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001；2.廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530201）

當(dāng)歸藤為紫金?？扑崽僮訉僦参锂?dāng)歸藤Embelia parvifloraWall.ex A.DC.的根與老藤［1］，具有補(bǔ)血活血、強(qiáng)腰膝等功效，常用于治療血虛諸證、月經(jīng)不調(diào)、腰腿疼痛等［1-3］。當(dāng)歸藤是廣西民間地方的傳統(tǒng)藥物，是壯族瑤族人民在長(zhǎng)期與疾病斗爭(zhēng)過程中積累起來(lái)用于防治疾病的重要藥材［4］。

目前國(guó)內(nèi)有關(guān)當(dāng)歸藤的報(bào)道并不是很多，課題組前期做了當(dāng)歸藤的化學(xué)成分預(yù)實(shí)驗(yàn)［5］，并從石油醚部位得到4 個(gè)化合物，鑒定其中的2 個(gè)化合物為豆甾醇和維生素E［6］，同時(shí)研究了其中紅色素的抗氧化作用［7］，運(yùn)用GC-MS 分析了當(dāng)歸藤揮發(fā)油的有關(guān)成分［8］，在藥理作用方面做了毒性、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗凝血作用的研究［9-10］。迄今對(duì)于當(dāng)歸藤藥材質(zhì)量控制的研究?jī)H有單一成分的含有量測(cè)定、顯微鑒定報(bào)道［11-15］，為深入開發(fā)利用當(dāng)歸藤藥材，擬建立其相應(yīng)的質(zhì)量控制方法。根據(jù)中藥多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法對(duì)12 批不同產(chǎn)地樣品進(jìn)行測(cè)定，初步建立能整體表征中藥所含成分及其質(zhì)量的HPLC 指紋圖譜［16-17］。根據(jù)HPLC 指紋圖譜，共標(biāo)定12 個(gè)共有峰，并鑒定其中的2 種特征峰的成分（兒茶素和沒食子酸）。運(yùn)用IBM SPSS Statistics 22.0 軟件及2012 版中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)對(duì)12 批不同產(chǎn)地的當(dāng)歸藤藥材進(jìn)行分析，以期為其開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料

Thermo U3000 超高效液相色譜儀（美國(guó)Thermo Barnstead 公司）；Bruke RmicrOTOF-QⅡ型液質(zhì)聯(lián)用型高分辨串聯(lián)質(zhì)譜儀（德國(guó)Bruke 公司）。e2695 型高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世科技有限公司）；BSA224S 電子天平（德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；TG16-WS 離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；KQ-500DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Simplicity-185 純水機(jī)（德國(guó)Millipore 公司）。

乙腈（色譜純，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）；磷酸（西隴化工股份有限公司）。對(duì)照品兒茶素（批號(hào)110877-201715）、沒食子酸（批號(hào)110831-201717）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。水為超純水，其他試劑均為分析純。

實(shí)驗(yàn)所用藥材來(lái)源及相關(guān)信息見表1，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室梁子寧副教授鑒定為當(dāng)歸藤Embelia parvifloraWall.ex A.DC.的根與老藤。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法

2.1 色譜條件 采用Phenomenex C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～15 min，3%A；15～25 min，8% A；25～60 min，8%～12%A；60～80 min，12% A）；體積流量0.8 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備 取兒茶素及沒食子酸對(duì)照品各適量，精密稱定，制成每1 mL 含對(duì)照品兒茶素1.012 mg、沒食子酸0.416 mg 的貯備液，備用。各取上述貯備液200 μL，置5 mL 量瓶中，定容，制成每1 mL 含兒茶 素40.48 μg、沒食子 酸16.64 μg 的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 稱取1.0 g 當(dāng)歸藤藥材粉末，過40 目篩，置于50 mL 錐形瓶中，精密加入85% 甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率35 kHz）1 h。放冷，再稱定質(zhì)量，用85%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過。將濾液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿濃縮至干，殘?jiān)?5% 甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至2 mL 量瓶中，用85% 甲醇定容，再過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取廣西恭城產(chǎn)地藥材（S5），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)測(cè)定6 次，以6 號(hào)峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，分別統(tǒng)計(jì)各共有峰的保留時(shí)間和峰面積，測(cè)得12 個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積RSD 分別小于1%、3%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一藥材粉末6 份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，以6 號(hào)峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，測(cè)得12 個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積的RSD 分別小于1%、3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱取同一藥材粉末，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，以6 號(hào)峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，測(cè)得12 個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積的RSD 分別小于1%、3%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 特征峰指認(rèn) 考慮出峰時(shí)間、峰形等因素，并比較樣品與對(duì)照品的色譜圖譜，初步判斷1 號(hào)峰為沒食子酸，6 號(hào)峰為兒茶素，將6 號(hào)峰確定為特征峰。為進(jìn)一步確認(rèn)這2 種成分，采用液質(zhì)聯(lián)用方法對(duì)當(dāng)歸藤藥材中的沒食子酸和兒茶素成分進(jìn)行分析鑒定。

2.5.1 色譜條件 Thermo Gold C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相0.1% 甲酸-水，含20 mmol/L 乙酸銨（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～2 min，10%～30% B；2～6 min，30%～50% B；6～8 min，50%～95% B；8～11 min，95%B；11～11.1 min，95%～10% B；11.1～15 min，10%B）；體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量0.2 μL。

2.5.2 質(zhì)譜條件 離子源為HESI；輔助氣體體積流量10 μL/min；輔助氣溫度300 ℃；離子傳輸管溫度320 ℃；正離子模式下，鞘氣體積流量40 μL/min；噴霧電壓3.50 kV；負(fù)離子模式下，鞘氣體積流量3 μL/min；噴霧電壓2.80 kV；m/z掃描范圍100～750。

2.5.3 結(jié)果分析 圖1～5 顯示，在相同保留時(shí)間處MS 一級(jí)二級(jí)圖譜中的碎片離子，對(duì)照品的離子碎片與當(dāng)歸藤樣品中相應(yīng)峰的離子碎片一致。

圖1 當(dāng)歸藤樣品質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrum of E.parviflora samples

圖2 負(fù)離子模式下沒食子酸樣品質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrum with negative ion mode of gallic acid samples

3 結(jié)果

3.1 指紋圖譜建立 按“2.3”項(xiàng)下方法制備12批不同產(chǎn)地的當(dāng)歸藤藥材供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，采集12 批樣品色譜圖，將其導(dǎo)入2012 版中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件，以S5 號(hào)的圖譜為參照?qǐng)D譜，標(biāo)定12 個(gè)共有峰，并指認(rèn)1 號(hào)峰為沒食子酸、6 號(hào)峰為兒茶素，以出峰穩(wěn)定的6 號(hào)峰為參照峰，生成當(dāng)歸藤共有模式的指紋圖譜，見圖6～7。

3.2 相似度分析 將12 批樣品的色譜圖導(dǎo)入2012 版中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件中，選擇廣西恭城產(chǎn)地當(dāng)歸藤藥材作為參照?qǐng)D譜，以中位數(shù)作為對(duì)照?qǐng)D譜的生成方法，采多點(diǎn)校正，時(shí)間窗0.1 min，全峰匹配，建立對(duì)照?qǐng)D譜。通過相似度計(jì)算結(jié)果分析得知，12 批樣品指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度大于0.940，表明各產(chǎn)地藥材的化學(xué)成分有較好的一致性，但各化學(xué)成分含有量存在一定差異。

圖3 兒茶素樣品質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectrum of catechin samples

圖4 兒茶素對(duì)照品質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectrum of catechin reference

圖5 負(fù)離子模式?jīng)]食子酸對(duì)照品質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectrum with negative ion mode of gallic acid reference

3.3 共有峰指認(rèn) 分析各產(chǎn)地色譜圖，選擇峰形特征明顯的色譜作為共有峰，12 批樣品樣品一共標(biāo)定出12 個(gè)共有峰，選擇出峰時(shí)間適中且峰形較為穩(wěn)定的6 號(hào)峰兒茶素作為參照峰，分別計(jì)算12個(gè)共有峰相對(duì)于該峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見表2～3。

圖6 各成分HPLC 色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of various constituents

圖7 12 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.7 HPLC fingerprints of twelve batches of samples

表2 12 批樣品共有峰相對(duì)保留時(shí)間Tab.2 Relative retention time of common peaks of twelve batches of samples

3.4 聚類分析 采用IBM SPSS Statistics 22.0 軟件對(duì)12 批樣品實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，采用Ward 法，平方Euclidean 距離（d）為度量標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見圖8。表明，當(dāng)d=10 時(shí)，12 批樣品可以分為2 類，S5、S6、S7 為一類，其余聚為一類；當(dāng)d=3 時(shí)，后一類又可以聚為2 類，S1、S2、S3、S8 為一類，S4、S9、S10、S11、S12 為一類；由于S5、S6、S7 在地域上差異不大，產(chǎn)地差異較小，故聚為一類。

3.5 主成分分析 采用IBM SPSS Statistics 22.0 軟件對(duì)12 批樣品進(jìn)行主成分分析，根據(jù)特征值與貢獻(xiàn)率分析，色譜圖中1、2、4、5、6、7、8、10、11、12 號(hào)峰的累積貢獻(xiàn)率最大，達(dá)到95.611%，結(jié)果見表5。將對(duì)應(yīng)的特征值做散點(diǎn)圖，結(jié)合圖9、表4 分析，提示這10 個(gè)累積貢獻(xiàn)率較大的峰可作為評(píng)價(jià)樣品品質(zhì)的主要因子。通過因子負(fù)荷矩陣分析，見表5，得到2 個(gè)主成分因子的線性方程。根據(jù)主成分1 和2 數(shù)據(jù)，整理出平面得分圖，見圖10，從得分圖中可以看出這12 批樣品分散在不同的區(qū)域，由于樣品來(lái)源于廣西的各個(gè)市縣，表明藥材的質(zhì)量跟地域分布有關(guān)。

4 討論

4.1 色譜柱考察 色譜柱的長(zhǎng)短對(duì)色譜分離效果有很大影響，本實(shí)驗(yàn)考察了150、250 mm 2 種色譜柱，結(jié)果表明，后者各色譜峰分離效果較好，故采用250 mm 色譜柱。

4.2 提取方法考察 本實(shí)驗(yàn)考察了超聲提取和回流提取2 種方法，并考察了不同體積分?jǐn)?shù)甲醇和乙醇，通過比較出峰數(shù)、峰形等，選擇85% 甲醇超聲60 min。

表4 主成分初始特征值和貢獻(xiàn)率Tab.4 Initial eigenvalues and contribution rates of principal components

表5 因子負(fù)荷矩陣Tab.5 Matrix of factor loadings

圖9 各成分主成分分析散點(diǎn)圖Fig.9 Scatter diagram of principal component analysis of various constituents

4.3 色譜柱以及流動(dòng)相考察 本實(shí)驗(yàn)考察了3 種不同型號(hào)的色譜柱，Phenomenex C18、Inertsil C18和Thermo C18，并同時(shí)考察了4 種常見的不同流動(dòng)相體系，根據(jù)峰形，峰數(shù)量以及分離度等綜合考慮，以Phenomenex C18色譜柱、乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫時(shí)，峰數(shù)較多，峰形較好。

圖10 主成分平面得分圖Fig.10 Score graph of principal components

4.3 波長(zhǎng)考察 本實(shí)驗(yàn)采用PDA 檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果表明在225 nm 波長(zhǎng)下，色譜圖的信息豐富，各色譜峰分離效果較好，無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象，基線相對(duì)平穩(wěn)，故檢測(cè)波長(zhǎng)為225 nm。

4.4 柱溫、體積流量考察 對(duì)比3 種不同體積流量的色譜圖，結(jié)果表明0.8 mL/min 的出峰時(shí)間較適宜，且峰分離度較好，故體積流量為0.8 mL/min。在柱溫選擇方面，對(duì)比了4 種常見的柱溫，以30 ℃時(shí)色譜峰分離效果、峰形等較好，故柱溫為30 ℃。

5 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 指紋圖譜結(jié)合特征峰含有量的變化控制當(dāng)歸藤藥材質(zhì)量，比單純測(cè)定藥材的某一成分含有量控制藥材的質(zhì)量更全面客觀；聚類分析結(jié)合HPLC 指紋圖譜，方法穩(wěn)定高效、簡(jiǎn)便且專屬性強(qiáng)，以期為對(duì)進(jìn)一步研究當(dāng)歸藤質(zhì)量評(píng)價(jià)及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。