叢長(zhǎng)虹，吳立鵬

(1.天津歐瑞圣彬科技有限公司和平區(qū)口腔門診部，天津 300050； 2.佳木斯大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 正畸科，黑龍江 佳木斯 154000)

血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有高度特異性的有絲分裂原[1]，與細(xì)胞表面受體特異性結(jié)合后，產(chǎn)生促進(jìn)新血管生成和增加血管通透性的作用，直接或間接調(diào)控血管發(fā)生、形成的各個(gè)環(huán)節(jié)，在胚胎發(fā)生、創(chuàng)傷愈合和腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中起重要作用[2]。咬合創(chuàng)傷是一種常見的口頜系統(tǒng)病理狀態(tài)，這種病理狀態(tài)不但引起牙體牙髓、牙周等病理性損害，也會(huì)對(duì)咀嚼肌、神經(jīng)、顳下頜關(guān)節(jié)的改建和病變產(chǎn)生一定影響[3-4]。本實(shí)驗(yàn)通過抬高咬合的方法建立大鼠咬合創(chuàng)傷動(dòng)物模型，采用免疫組織化學(xué)的方法觀察了VEGF在咬合創(chuàng)傷不同時(shí)期髁突軟骨的表達(dá)，探討VEGF在髁突軟骨破壞和改建中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 選取2個(gè)月齡健康雄性Wistar大鼠50只，體質(zhì)量240～260 g(由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，無缺牙、牙頜畸形及嚴(yán)重牙體組織磨損，標(biāo)準(zhǔn)條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(包括咬合創(chuàng)傷7 d組、14 d組、21 d組、28 d組)和對(duì)照組，每組10只。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用塊狀飼料喂養(yǎng)，自由飲食。

1.2 試劑 VEGF抗體(Santa Cruz，美國(guó))，抗體稀釋液(DAKO，丹麥)，通用型生物素化IgG(DAKO，丹麥)，DAB顯色試劑盒(Santa Cruz，美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物采用速眠新按0.001 mL·g-1體質(zhì)量行左后肢肌內(nèi)注射，麻醉顯效后用自制牽引拉鉤拉開上下頜，高速手機(jī)上直徑1.0 mm金剛砂球鉆打磨粗糙右上第一磨牙合面。將預(yù)先按合面大小修整好高0.5 mm的不銹鋼舌側(cè)扣用充填用復(fù)合樹脂粘接于合面。

1.4 標(biāo)本制備 對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物到達(dá)預(yù)定時(shí)間點(diǎn)后，行速眠新麻醉，應(yīng)用40 g·L-1多聚甲醛心臟灌注固定。切取右側(cè)下頜骨髁突浸入40 g·L-1多聚甲醛液繼續(xù)固定1周，混合脫鈣液脫鈣25 h。制成5 μm厚髁突矢狀向連續(xù)石蠟切片，行HE染色和VEGF免疫組織化學(xué)染色。

1.5 免疫組織化學(xué)染色觀察 石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度酒精水化；于室溫下30 g·L-1H2O2孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，切片蒸餾水洗3次；微波修復(fù)抗原：將切片浸入0.01 M、pH 6.0的枸櫞酸緩沖液中微波修復(fù)抗原，5 min 3次，然后室溫冷卻；PBS緩沖液洗3次，每次5 min；滴加血清封閉液，室溫下20 min；滴加VEGF抗體，4 ℃孵育過夜；PBS沖洗3次，每次5 min，滴加通用型生物素化IgG，37 ℃下孵育20 min；PBS沖洗3次，每次2 min；DAB顯色，蒸餾水沖洗；梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。陰性對(duì)照采用PBS代替一抗，其余步驟同上。

光鏡下，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)均勻棕色染色定義為VEGF陽性。每個(gè)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本均隨機(jī)選取4個(gè)高倍視野(×400)，計(jì)數(shù)視野內(nèi)陽性細(xì)胞總數(shù)，并通過公式：陽性細(xì)胞表達(dá)率=陽性細(xì)胞總數(shù)/細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞表達(dá)率。

2 結(jié)果

2.1 石蠟切片HE染色結(jié)果 光學(xué)顯微鏡下，對(duì)照組髁突軟骨分為4層結(jié)構(gòu)：由表及里分別為關(guān)節(jié)表面帶，主要由互相平行排列的膠原纖維構(gòu)成，這些纖維與軟骨表面平行，其間可見散在纖維細(xì)胞；增殖帶，由7～10層排列比較密集的細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞體積較小，可見核分裂相；肥大帶，含3～5列軟骨細(xì)胞，細(xì)胞體積較大；鈣化軟骨帶，是軟骨與其下方的骨組織相互移行的部分。

實(shí)驗(yàn)組咬合創(chuàng)傷7 d時(shí)，未見明顯的軟骨表面形態(tài)變化，增殖帶出現(xiàn)不同程度增厚，同時(shí)增殖帶細(xì)胞數(shù)量增多；咬合創(chuàng)傷14 d，軟骨表面曲度變平，增殖帶的寬度繼續(xù)增厚，并且軟骨細(xì)胞增多；咬合創(chuàng)傷21 d，軟骨表面變平，關(guān)節(jié)表面帶局部變得不完整，增殖帶細(xì)胞數(shù)量增多；咬合創(chuàng)傷28 d，軟骨出現(xiàn)增厚，關(guān)節(jié)表面帶不完整，增殖帶細(xì)胞呈簇狀增生，伴有軟骨層次紊亂。見圖1。

圖1 對(duì)照組(A)和咬合創(chuàng)傷21 d組(B)髁突軟骨(HE×200)

2.2 VEGF免疫組化染色結(jié)果 對(duì)照組VEGF陽性細(xì)胞主要分布于髁突軟骨的增殖帶和肥大帶表層。咬合創(chuàng)傷7 d組、21 d組VEGF在髁突軟骨各層細(xì)胞的表達(dá)均出現(xiàn)增強(qiáng)，在肥大帶的表達(dá)增強(qiáng)尤為明顯。見圖2。咬合創(chuàng)傷28 d組VEGF的表達(dá)在髁突軟骨各層均降低。各組髁突軟骨VEGF陽性細(xì)胞率統(tǒng)計(jì)分析見表1。

圖2 VEGF在對(duì)照組(A)和咬合創(chuàng)傷21 d組(B)髁突軟骨的表達(dá)(免疫組化×200)

表1 各組髁突軟骨VEGF陽性細(xì)胞率比較

注：與正常對(duì)照組相比，aP<0.05(Dunnett-t檢驗(yàn))。

3 討論

咬合創(chuàng)傷是由于不正常的咬合接觸關(guān)系和咀嚼系統(tǒng)的異常功能，造成咀嚼系統(tǒng)某些部位出現(xiàn)病理性損害或適應(yīng)性變化。臨床中不均勻的磨耗，牙周病，不良修復(fù)體，以及正畸治療中均可能出現(xiàn)咬合創(chuàng)傷。咬合創(chuàng)傷的存在不但對(duì)受累牙的牙體、牙髓和牙周組織產(chǎn)生一定的影響，產(chǎn)生牙體磨損、折斷、牙髓病變及牙齒松動(dòng)、移位、牙槽骨吸收等損害，也會(huì)影響到顳下頜關(guān)節(jié)的功能和改建。已有研究表明，嚴(yán)重的咬合創(chuàng)傷可引起顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎[5]。

在大鼠第一磨牙上粘接充填樹脂、正畸用不銹鋼方絲或金屬冠等方法是常用的建模方法[6-8]。本研究采用在大鼠右上第一磨牙上粘接預(yù)先調(diào)整的正畸用不銹鋼舌側(cè)扣的方法，使咬合抬高0.5 mm。舌側(cè)扣具有網(wǎng)底，易于與磨牙牢固粘接，操作簡(jiǎn)單，且金屬材質(zhì)較耐磨，便于建立穩(wěn)定的咬合創(chuàng)傷狀態(tài)。

通過光學(xué)顯微鏡組織切片觀察，咬合創(chuàng)傷初期，關(guān)節(jié)軟骨表面開始出現(xiàn)形態(tài)變化。隨著咬合創(chuàng)傷的持續(xù)存在，髁突軟骨出現(xiàn)增厚，增殖帶細(xì)胞體積變大，數(shù)量增多及軟骨層次的紊亂，表明在咬合創(chuàng)傷初期，髁突軟骨表現(xiàn)出適應(yīng)性改變，隨著咬合創(chuàng)傷的持續(xù)，髁突軟骨變得逐漸失去代償，進(jìn)一步可能導(dǎo)致軟骨病理性變化。

VEGF是血管源性多肽，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有強(qiáng)大的特異性的促分裂和趨化作用[9]。在軟骨的發(fā)育過程中，軟骨肥大帶細(xì)胞產(chǎn)生的VEGF通過與其受體結(jié)合，對(duì)發(fā)育期軟骨的血管發(fā)生和血管新生起重要作用。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，VEGF在髁突軟骨的表達(dá)主要在增殖帶和肥大帶，咬合創(chuàng)傷后，髁突軟骨VEGF的表達(dá)水平逐漸增高，且在肥大帶的表達(dá)增強(qiáng)更為明顯。有文獻(xiàn)表明，關(guān)節(jié)在機(jī)械負(fù)荷的作用下，VEGF通過自分泌的方式對(duì)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生影響[10]。關(guān)節(jié)軟骨是一種無血管的組織，咬合抬高后，破壞了關(guān)節(jié)的正常應(yīng)力結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致髁突軟骨的負(fù)荷增加。咬合創(chuàng)傷導(dǎo)致的工作側(cè)髁突壓力增大，繼而誘導(dǎo)產(chǎn)生VEGF，VEGF與軟骨細(xì)胞表面受體結(jié)合后，導(dǎo)致基質(zhì)產(chǎn)生破壞。結(jié)合前述的觀點(diǎn)可以推測(cè)，VEGF在咬合創(chuàng)傷髁突軟骨的改建過程中起重要作用，但確切的作用機(jī)制值得進(jìn)一步探討。另外，本文僅就咬合創(chuàng)傷時(shí)工作側(cè)髁突軟骨的VEGF表達(dá)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，非工作側(cè)VEGF的表達(dá)尚需進(jìn)一步觀察。