馬新義 ，許 勵，王桂花

(1.杭州迪安醫(yī)學(xué)檢驗中心 病理實驗室, 浙江 杭州 310030; 2. 杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院 病理科, 浙江 杭州 310015)

2018年全球約有57萬新發(fā)宮頸癌病例和31.1萬死亡宮頸癌病例，其發(fā)病率和死亡率均居所有女性惡性腫瘤的第4位[1]。我國每年的宮頸癌新發(fā)病例占世界總新發(fā)病例的20%～30%，且以每年2%～3%的速度遞增，并呈年輕化的趨勢[2]。WHO女性生殖系統(tǒng)分類將宮頸癌前病變命名為宮頸上皮內(nèi)瘤變，并分為低級別鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial leisons/cervical intraepithelial neoplasm grade 1, LSIL/CIN1)和高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL)。根據(jù)美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)宮頸癌篩查指南，LSIL的治療以臨床觀察為主，密切隨訪，HSIL需要宮頸局部治療。但LSIL中隱含著HSIL的風(fēng)險，尋找有效的早期預(yù)測因子對提示LSIL的轉(zhuǎn)歸和對初次確診為LSIL的患者進(jìn)行分流干預(yù)具有積極意義。本研究探討P16和Ki-67在LSIL/CIN1中的表達(dá)情況及與預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年8月—2018年10月因可疑宮頸病變在杭州迪安醫(yī)學(xué)檢驗中心行陰道鏡下宮頸活檢，經(jīng)組織學(xué)病理診斷為宮頸LSIL/CIN1的84例患者為研究對象。所選LSIL/CIN1患者年齡27～69歲，平均(44.7±9.1)歲。另選取同期經(jīng)組織學(xué)病理診斷為非腫瘤性正常宮頸組織22例，年齡22～65歲，平均(43.0±5.7)歲。本研究經(jīng)杭州迪安醫(yī)學(xué)檢驗中心倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 檢測方法 組織標(biāo)本經(jīng)中性甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋、4 μm連續(xù)切片后經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精至水，常規(guī)蘇木素-伊紅(hematoxylon-eosin，HE)染色，免疫組化實驗操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。采用Ventana 全自動免疫組化染色儀(瑞士羅氏公司)檢測P16的表達(dá)情況，采用EnVision二步法進(jìn)行免疫組化檢測Ki-67的表達(dá)情況， Ki-67單克隆抗體(克隆號：7B11)購于北京中杉金橋生物有限公司；P16單克隆抗體(克隆號：E6H4)購于上海羅氏有限公司。P16陽性定位于細(xì)胞核或細(xì)胞漿內(nèi)，胞漿及細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒判讀為陽性細(xì)胞，散在或者無棕色顆粒染色判讀為陰性細(xì)胞[3]。Ki-67陽性定位于細(xì)胞核，以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色或棕色顆粒判定為陽性細(xì)胞。陽性細(xì)胞表達(dá)率：陽性細(xì)胞率0%～<5%為陰性(-)，5%～<25 %為弱陽性(+)，25 %～<50 %為陽性(++)，≥50 %為強陽性(+++)。免疫組化結(jié)果由2位資深婦科?？撇±磲t(yī)師采用雙盲法閱片判讀。

1.3 預(yù)后判讀 每位隨訪病例均經(jīng)巴氏涂片檢查、陰道鏡活檢和HR-HPV檢測。疾病進(jìn)展：組織學(xué)診斷結(jié)果為HSIL/CIN2及以上級別病變；消退：標(biāo)本組織學(xué)診斷結(jié)果為陰性；病變持續(xù)：宮頸活檢或?qū)m頸細(xì)胞學(xué)結(jié)果為LSIL/CIN1[4]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用Fisher精確檢驗或卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P16和Ki-67的表達(dá)情況 LSIL/CIN1病例標(biāo)本中P16陽性表達(dá)率為28.6%(24/84)，正常/炎癥病例中P16未見表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=46.124，P<0.001)。Ki-67在LSIL/CIN1病例標(biāo)本中的陽性表達(dá)率(52.4%，44/84)高于在宮頸正常/炎癥組中的陽性表達(dá)率(22.7%，5/22)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.792，P=0.003)。LSIL/CIN1組Ki-67陽性細(xì)胞表達(dá)率(5%～<25%)的比例為42.9%(36/84), 陽性細(xì)胞表達(dá)率(25%～<50%)的比例為9.5%(8/84)；宮頸正常/炎癥組Ki-67陽性細(xì)胞表達(dá)率(5%～<25%)的比例為22.7%(5/22)，未見陽性細(xì)胞表達(dá)率(25%～<50%)的病例。見封三圖1、圖2。

2.2 P16和Ki-67表達(dá)與LSIL/CIN1預(yù)后的關(guān)系 隨訪12個月，復(fù)查結(jié)果顯示，84例LSIL/CIN1病例中有47例病變消退，24例持續(xù)，13例進(jìn)展。LSIL/CIN1進(jìn)展組病例中P16陽性表達(dá)率(76.9%，10/13)高于持續(xù)組(25.0%，6/24)和消退組(19.1%，9/47)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；LSIL/CIN1進(jìn)展組Ki-67陽性表達(dá)率(100.0%，13/13)高于持續(xù)組(54.2%，13/24)和消退組(38.3%，18/47)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Ki-67陽性細(xì)胞表達(dá)率(25%～<50%)的病例中，進(jìn)展組比例(38.5%，5/13)高于持續(xù)組(8.3%，2/24)和消退組(2.1%，1/47)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 P16和Ki-67表達(dá)與LSIL/CIN1預(yù)后的關(guān)系

3 討論

HPV感染尤其是HR-HPV持續(xù)感染是誘發(fā)宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變及宮頸癌的主要危險因素和必要條件之一[5-7]。P16是高危型HPV感染存在的標(biāo)志[8]，也是HPV具有轉(zhuǎn)錄活性即具有真正致瘤作用的標(biāo)志。P16阻止細(xì)胞從G1期到S期，負(fù)性調(diào)控細(xì)胞增殖及分裂，具有抑癌作用[9]。人感染高危型HPV后，高危型HPV DNA整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組導(dǎo)致E6和E7病毒基因表達(dá)，E6降解P53，E7結(jié)合pRb并使其失活，致使pRb喪失對p16基因的負(fù)反饋抑制作用，導(dǎo)致P16蛋白呈現(xiàn)過表達(dá)[10]。有文獻(xiàn)報道[11]，98%以上的高危型HPV感染顯示P16呈彌漫陽性，P16甚至可以作為高危型HPV檢測的代替物，其敏感性和特異性達(dá)80%。在低級別宮頸上皮內(nèi)瘤變中，P16染色陰性存在較高的倒退傾向，染色陽性的更傾向于發(fā)展至高級別病變[12]，P16不僅在宮頸上皮內(nèi)瘤變的分級診斷中具有重要臨床意義，還在宮頸癌前病變進(jìn)展的風(fēng)險評估中具有應(yīng)用價值。本研究結(jié)果顯示，LSIL/CIN1病例標(biāo)本中P16陽性表達(dá)率明顯高于正常/炎癥病例中的表達(dá)，這與Zhang等[13]的報道結(jié)果相一致，提示P16在良性或反應(yīng)性改變與高危型HPV感染相關(guān)的宮頸前驅(qū)病變之間的鑒別診斷中具有一定意義，P16陽性支持其為HPV感染性鱗狀上皮內(nèi)病變，但是陰性并不能排除LSIL。劉苗[14]的研究顯示，P16的表達(dá)率會隨著宮頸鱗狀病變級別升高而呈上升趨勢，在正常細(xì)胞周期中P16不表達(dá)；但當(dāng)細(xì)胞周期調(diào)控機制受損時，P16增殖活躍；隨著宮頸病變級別的增高，P16呈現(xiàn)高表達(dá)。本研究病例隨訪結(jié)果顯示，LSIL/CIN1進(jìn)展組病例中P16陽性表達(dá)率明顯高于維持組和消退組；提示P16在預(yù)測CIN1病人預(yù)后進(jìn)展中具有一定應(yīng)用價值。但Herfs等[15]報道指出，P16在非鱗狀上皮內(nèi)病變中可能出現(xiàn)假陽性，單獨應(yīng)用P16標(biāo)記尚不能作為宮頸上皮內(nèi)瘤病變的診斷依據(jù)，需聯(lián)合其他標(biāo)記物才可以進(jìn)行確定診斷。

細(xì)胞分裂、增殖的異常活躍是腫瘤惡變的重要環(huán)節(jié)。Ki-67是一種重要的反映腫瘤增殖活性的蛋白，與增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)相結(jié)合的單抗，標(biāo)記細(xì)胞核及染色體處于G1、S、G2和M期，以此確定腫瘤生長率，Ki-67與腫瘤的增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)[16]。近年來，有關(guān)Ki-67表達(dá)與婦科腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系成為研究熱點。Marko等[17]發(fā)現(xiàn)Ki-67在HR-HPV感染的宮頸上皮中高表達(dá)，Ki-67的陽性指數(shù)隨CIN級別的升高逐漸增加。本研究結(jié)果顯示，Ki-67在LSIL/CIN1病例標(biāo)本中的陽性表達(dá)率明顯高于在宮頸正常/炎癥病例中的陽性表達(dá)率，說明在宮頸低級別CIN組織中存在異常分裂、增殖；LSIL/CIN1進(jìn)展組Ki-67陽性表達(dá)率明顯高于持續(xù)組和消退組，提示Ki-67的表達(dá)陽性可以預(yù)測CIN1病人預(yù)后進(jìn)展；Ki-67陽性細(xì)胞表達(dá)率(25%～<50%)的病例中，進(jìn)展組陽性表達(dá)率明顯高于持續(xù)組和消退組，說明Ki-67表達(dá)越高，進(jìn)展的風(fēng)險越高，這與王曉平等[18]的報道結(jié)果相似。

綜上所述，P16和Ki-67的陽性表達(dá)有助于鑒別宮頸低級別鱗狀上皮內(nèi)病變與宮頸炎癥性病變和預(yù)測宮頸低級別鱗狀上皮內(nèi)病變的預(yù)后結(jié)果。