劉慧敏 郝聚敏 許凈 鄢慶枇 高晗 鄭江

摘?要?共有位點(diǎn)是指不同微生物上結(jié)構(gòu)相同或相似的位點(diǎn)，有些共有位點(diǎn)是同種或同屬微生物所共有的，可以作為微生物種屬鑒定的標(biāo)記位點(diǎn)。因此，篩選這些共有位點(diǎn)的共有核酸適配體，不僅有助于對(duì)這些微生物進(jìn)行總量分析，對(duì)于相關(guān)微生物的種屬鑒定也具有重要意義。本研究以哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）為靶目標(biāo)，篩選這兩種弧菌共有位點(diǎn)的共有核酸適配體。經(jīng)過(guò)8輪篩選，適配體富集庫(kù)的親和力提高了24.1倍，同源性分析表明，適配體富集庫(kù)呈明顯的收斂性，表現(xiàn)了較好的篩選效率。對(duì)2個(gè)核酸適配體C14和C22的親和性和特異性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，這兩個(gè)核酸適配體對(duì)哈維氏弧菌和溶藻弧菌都有較好的親和性和特異性，但對(duì)哈維氏弧菌的親和力要顯著高于溶藻弧菌，而對(duì)非弧菌屬的嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）和遲鈍愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella tarda）的親和力較弱。C14對(duì)哈維氏弧菌和溶藻弧菌的親和常數(shù)（Kd）分別為55.76和82.88 nmol/L，C22對(duì)哈維氏弧菌和溶藻弧菌的親和常數(shù)分別為33.97和43.95 nmol/L。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示，兩個(gè)核酸適配體都以莖環(huán)結(jié)構(gòu)為主，其中C22的3′端結(jié)構(gòu)比C14更復(fù)雜。熒光顯微鏡下，與核酸適配體孵育的哈維氏弧菌、溶藻弧菌、嗜水氣單胞菌、遲鈍愛(ài)德華氏菌和大腸桿菌（Escherichia coli）中，只有哈維氏弧菌和溶藻弧菌呈現(xiàn)出明顯亮黃色的熒光，其它3種菌則無(wú)顯著熒光，進(jìn)一步證明了兩個(gè)核酸適配體對(duì)這兩種弧菌有較好的親和性和特異性。本研究為這兩種弧菌的識(shí)別檢測(cè)及水產(chǎn)病原弧菌的種屬鑒定奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞?哈維氏弧菌;溶藻弧菌;共有核酸適配體;篩選;熒光顯微鏡

1?引 言

哈維氏弧菌（Vibrio harveryi）和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）等水產(chǎn)病原弧菌是養(yǎng)殖環(huán)境中的重要病原菌，可感染石斑魚(yú)、銀鯛、軍曹魚(yú)、鱸魚(yú)、對(duì)蝦、蟹類(lèi)等多種水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的損失[1～4]。另外，它們還可通過(guò)食物和水傳播，進(jìn)而感染人類(lèi)，嚴(yán)重威脅公共安全[5，6]。因此，對(duì)這些弧菌進(jìn)行快速的檢測(cè)和鑒定十分必要。但由于弧菌的種類(lèi)多、變異快、基因相似度較高，傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法和16SrDNA等檢測(cè)方法對(duì)弧菌的檢測(cè)鑒定效果并不理想[7，8]。

核酸適配體是經(jīng)體外篩選得到的、長(zhǎng)度>10 nt的寡核苷酸序列，可以高效、特異地與靶目標(biāo)結(jié)合，在病原微生物的識(shí)別檢測(cè)、食品安全和靶向治療等領(lǐng)域得到廣泛的關(guān)注[9～12]。然而，目前篩選出的病原微生物的核酸適配體大多識(shí)別的是微生物上的特異性位點(diǎn)。

微生物的表面存在有多種位點(diǎn)，有些位點(diǎn)是某種微生物所獨(dú)有的特異性位點(diǎn)，有些位點(diǎn)則是一些微生物上結(jié)構(gòu)相同或相似的位點(diǎn)，即共有位點(diǎn)。共有位點(diǎn)中有些是同種或同屬微生物所共有的，具有種屬特異性，可以作為微生物種屬鑒定的標(biāo)記位點(diǎn)。對(duì)這些共有位點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別，篩選其共有核酸適配體，不僅有助于對(duì)這些微生物進(jìn)行總量分析，對(duì)于相關(guān)微生物的種屬鑒定也具有重要意義。對(duì)于不同病原微生物中共有位點(diǎn)的識(shí)別及其核酸適配體的篩選，目前還未見(jiàn)報(bào)道。本研究以溶藻弧菌和哈維氏弧菌為共同的靶目標(biāo)，篩選能特異性識(shí)別這兩種弧菌共有位點(diǎn)的核酸適配體，為后續(xù)這兩種微生物的識(shí)別檢測(cè)及其種屬的識(shí)別鑒定奠定了基礎(chǔ)。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

BIO-TEK全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Synergy HT公司）;MG96G PCR儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司）;BioDoc-It凝膠成像一體機(jī)（美國(guó)UVP公司）;TGL-16C高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）;JM-250電泳儀和電泳槽（大連竟邁生物科技有限公司）;SW-CJ超凈工作臺(tái)（蘇州泰安空氣技術(shù)有限公司）;HI98127 pH計(jì)（意大利Hanna公司）;DM5000B熒光顯微鏡（德國(guó)萊卡公司）。

隨機(jī)ssDNA文庫(kù)： 5′-TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC-N35-GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3′ （兩端為與引物結(jié)合的固定序列，中間為35nt的隨機(jī)序列）;引物P1： 5′-TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC-3′，引物P2： 5′-CCC TCT GGG GTC TCC CTC TTG TGC-3′，引物P3： 5′端標(biāo)記有地高辛的引物P1;5′端標(biāo)記有FAM熒光基團(tuán)的核酸適配體C14： FAM-5′-TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC GGG GGC GCG GTG AGG GGC TGC ACA AGA GGG AGG CAC AAG AGG GAG GCA CAA GAG GGA GAG CCC AGA GGG-3′;5′端標(biāo)記有FAM熒光基團(tuán)的核酸適配體C22： FAM-5′-TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC TGC AGG GCC AGA ACA GGG GGA AGG CAC AAG AGG GAG CAC AAG AGG GAG GCA CAA GAG GGA GAG CCC AGA GGG-3′。以上文庫(kù)、引物及核酸適配體序列均由上海生工生物公司合成和標(biāo)記。Dreamtaq DNA聚合酶和緩沖液購(gòu)自Fermentas公司;dNTP購(gòu)自Generay Biotech公司;DNA marker購(gòu)自天根生化科技有限公司;瓊脂糖購(gòu)自廈門(mén)太陽(yáng)馬生物工程有限公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗地高辛抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)公司。實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

20×結(jié)合緩沖液： ?5.844 g NaCl、 3.725 g KCl、6.06 g三羥甲基氨基甲烷（Tris-HCl）和2.033 g MgCl2·6H2O用超純水溶解并定容至100 mL，調(diào)pH至7.4，使用時(shí)用超純水稀釋為2×和1×緩沖液。番紅染色液： 番紅O（safranine）2.5 g，溶于100 mL 95%乙醇中，配成番紅原液，于密閉的棕色瓶中避光保存。使用時(shí)稀釋5倍，配成番紅染色液。

2.2?微生物及培養(yǎng)基

目標(biāo)菌： 哈維氏弧菌（V. harveryi）、溶藻弧菌（V. alginolyticus）;非目標(biāo)菌： 嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、遲鈍愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella tarda）、 大腸桿菌（Escherichia coli）。大腸桿菌采用LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，其它菌采用胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）進(jìn)行培養(yǎng)。所用微生物由集美大學(xué)病原微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

2.3?共有核酸適配體的篩選

2.3.1?ssDNA文庫(kù)與目標(biāo)菌哈維氏弧菌結(jié)合?篩選流程如圖1所示，具體過(guò)程如下： 分別取哈維氏弧菌菌液（含菌量為4×108個(gè)），6000 r/min離心5 min，棄上清液，1×結(jié)合緩沖液洗滌1次，2×結(jié)合緩沖液100 μL懸浮菌沉淀;然后取10 μmol/L 隨機(jī)ssDNA文庫(kù)30 μL，用2×結(jié)合緩沖液稀釋至100 μL，95℃變性5 min，冰浴10 min后，加入到上述菌懸液中，30℃，100 r/min搖振結(jié)合一定時(shí)間： 第1和第2輪的篩選分別結(jié)合2 h，第3輪篩選結(jié)合1 h，第4輪以后的篩選結(jié)合0.5 h。完成結(jié)合后的菌懸液于6000 r/min離心5 min，棄上清液，用1×結(jié)合緩沖液洗沉淀1～3次（其中，第1和第2輪篩選洗滌1次，第3輪篩選洗滌2次，第4輪以后的篩選洗滌3次），洗去未與目標(biāo)菌哈維氏弧菌結(jié)合的或結(jié)合較弱的ssDNA。再在沉淀中加入1×結(jié)合緩沖液100 μL重懸，96℃加熱5 min，使與目標(biāo)菌結(jié)合的ssDNA變性，從而與目標(biāo)菌分離，15000 r/min離心10 min，取上清液，得到可與目標(biāo)菌哈維氏弧菌結(jié)合的ssDNA。

2.3.2?與目標(biāo)菌溶藻弧菌結(jié)合

將分離到的可與哈維氏弧菌結(jié)合的ssDNA（約100 μL），按照2.3.1節(jié)的方法與溶藻弧菌菌液結(jié)合和分離，從而得到能同時(shí)結(jié)合哈維氏弧菌和溶藻弧菌的ssDNA。

2.3.3?不對(duì)稱(chēng)PCR擴(kuò)增?25 μL PCR反應(yīng)體系： 1 μL 10 μmol/L引物P1，1 μL 0.2 μmol/L引物P2，0.4 μL 10 mmol/L dNTP，2 μL 10×PCR Buffer，1.2 μL 25mmol/L MgCl2，2 μL模板（即經(jīng)過(guò)2.3.1和2.3.2節(jié)后分離得到的ssDNA），0.2 μL 5 U/μL DNA聚合酶，17.2 μL ddH2O。PCR循環(huán)參數(shù)： 94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸20 s;?40個(gè)循環(huán)，最后于72℃延伸7 min。

2.3.4?循環(huán)重復(fù)篩選?取不對(duì)稱(chēng)PCR產(chǎn)物100 μL作為次級(jí)文庫(kù)，依次與目標(biāo)菌哈維氏弧菌和溶藻弧菌（數(shù)量各為4×108個(gè)）結(jié)合，重復(fù)上述2.3.1至2.3.3節(jié)中的步驟，共進(jìn)行8個(gè)循環(huán)的篩選。

2.3.5?反篩?為提高核酸適配體的特異性，分別在第4輪用非目標(biāo)菌嗜水氣單胞菌進(jìn)行了一次反篩，在第6輪用遲鈍愛(ài)德華氏菌進(jìn)行了一次反篩，以去除能與嗜水氣單胞菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌結(jié)合的ssDNA。具體方法如下： 取非目標(biāo)菌菌液（含菌量為4×108個(gè)），按2.3.1節(jié)的方法與次級(jí)文庫(kù)100 μL結(jié)合0.5 h，然后以6000 r/min離心5 min，取上清液，再按2.3.1到2.3.3節(jié)中步驟進(jìn)行正常篩選。

2.4?克隆測(cè)序及結(jié)構(gòu)分析

以最后一輪（即第8輪）篩選產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。25 μL PCR體系： 0.5 μL 10 μmol/L引物P1，0.5 μL 10 μmol/L引物P2，0.5 μL 10 mmol/L dNTP，2.5 μL 10×PCR buffer，1.5 μL 25 mmol/L MgCl2，2 μL模板，0.25 μL 5 U/μL DNA聚合酶，17.25 μL ddH2O;熱力學(xué)循環(huán)參數(shù)： 94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸20 s;擴(kuò)增35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行克隆測(cè)序。對(duì)測(cè)序獲得的一級(jí)結(jié)構(gòu)序列用DNAMAN軟件進(jìn)行同源性分析，并構(gòu)建同源樹(shù)，二級(jí)結(jié)構(gòu)用RNAstructure4.6軟件按能量最低原則進(jìn)行模擬分析。

2.5?地高辛-抗體-過(guò)氧化物酶法測(cè)定核酸適配體的親和力

參考文獻(xiàn)[13]方法，利用地高辛-抗地高辛抗體-過(guò)氧化物酶法測(cè)定核酸適配體的親和力。其原理為： 有地高辛標(biāo)記的核酸適配體與菌結(jié)合后形成地高辛標(biāo)記的復(fù)合物，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛的抗體識(shí)別和結(jié)合菌復(fù)合物上的地高辛，形成辣根過(guò)氧化物酶-抗體-地高辛-核酸適配體-菌的復(fù)合物，最后通過(guò)辣根過(guò)氧化物酶的顯色反應(yīng)產(chǎn)生的OD值表征與菌結(jié)合的適配體的親和力，顯色越深，OD值越高，親和力越高。其中，篩選過(guò)程中篩選產(chǎn)物的親和力測(cè)定是通過(guò)PCR將地高辛標(biāo)記到核酸適配體上，而純核酸適配體的親和力測(cè)定中，則是直接采用已標(biāo)記有地高辛的核酸適配體，無(wú)需PCR擴(kuò)增。具體方法如下所述。

2.5.1?篩選產(chǎn)物的親和力測(cè)定?篩選產(chǎn)物是篩選過(guò)程中獲得的含有多種適配體的混合物，對(duì)其進(jìn)行親和力測(cè)定可以跟蹤反映篩選進(jìn)行的效果。分別取哈維氏弧菌和溶藻弧菌菌液（各4×108個(gè)），1×結(jié)合緩沖液洗滌1次，棄上清液;2×結(jié)合緩沖液100 μL懸浮菌沉淀后，將兩種菌懸液混合作為靶目標(biāo)菌液。同時(shí)用引物P2和P3（即帶地高辛標(biāo)記的P1引物）對(duì)各輪篩選產(chǎn)物進(jìn)行不對(duì)稱(chēng)PCR擴(kuò)增（不對(duì)稱(chēng)PCR參數(shù)同上，用引物P3代替引物P1），得到各輪篩選產(chǎn)物的不對(duì)稱(chēng)PCR產(chǎn)物。取這些帶有地高辛標(biāo)記的不對(duì)稱(chēng)PCR產(chǎn)物各50 μL于離心管中作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)用2×結(jié)合緩沖液50 μL代替不對(duì)稱(chēng)PCR產(chǎn)物作為對(duì)照組，于95℃變性5 min，然后冰浴10 min后，加到上述100 μL的目標(biāo)菌懸液中，30℃下，100 r/min搖床結(jié)合30 min;?6000 r/min離心5 min，棄上清液，1×結(jié)合緩沖液洗滌1次，然后加入100 μL用TBS稀釋過(guò)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗地高辛抗體（稀釋的體積比為抗體∶TBS=1∶1000），充分混合后反應(yīng)10 min;離心，棄上清液，1×結(jié)合緩沖液洗滌3次，加入200 μL TMB顯色液避光顯色10 min后，用200 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀于450 nm測(cè)定OD值，獲得相應(yīng)的親和力： 親和力= OD450（實(shí)驗(yàn)組）-OD450（對(duì)照組）。

2.5.2?核酸適配體的親和力測(cè)定?分別取標(biāo)有地高辛的核酸適配體各50 μL（0.2 μmol/L）作為實(shí)驗(yàn)組，用2×結(jié)合緩沖液50 μL代替適配體作為對(duì)照組，按2.5.1節(jié)的方法與菌液結(jié)合、洗滌后進(jìn)行顯色反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)450 nm的OD值，獲得相應(yīng)適配體的親和力： 親和力= OD450（實(shí)驗(yàn)組）-OD450（對(duì)照組）。

2.6?親和常數(shù)的測(cè)定

將5′端標(biāo)記地高辛的核酸適配體稀釋到不同濃度，濃度范圍為0～140 nmol/L，然后分別與等量的哈維氏弧菌（4×108個(gè)）結(jié)合，按2.5.2節(jié)方法測(cè)定相應(yīng)濃度下此適配體的親和力。以適配體濃度為橫坐標(biāo)，親和力為縱坐標(biāo)，用Origin 8.0軟件的Hyperbola函數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析，獲得相應(yīng)適配體與哈維氏弧菌的結(jié)合曲線、親和常數(shù)Kd值及其擬合系數(shù)。按同樣的方法可得到適配體與溶藻弧菌的結(jié)合曲線、親和常數(shù)和擬合系數(shù)。

2.7?熒光顯微鏡觀察驗(yàn)證適配體的親和性和特異性

用2×結(jié)合緩沖溶液將濃度為10 μmol/L的5′端標(biāo)記有熒光基團(tuán)FAM的核酸適配體稀釋3000倍，然后于95℃變性5 min，冰浴10 min。各取100 μL濃度為108 cfu/mL菌液于6個(gè)離心管中，在3管中加入100 μL上述處理過(guò)的核酸適配體作為實(shí)驗(yàn)組，另外3管加入100 μL 2×緩沖溶液作為空白對(duì)照組，然后在30℃、100 r/min搖床結(jié)合30 min。然后6000 r/min離心5 min，棄上清液，2×結(jié)合緩沖溶液洗滌2次后，用100 μL 2×結(jié)合緩沖溶液重懸。取重懸后的混合菌液1 μL涂于玻片上，酒精燈加熱固定，再用番紅染液染色1 min后，用超純水洗凈，晾干后，置于熒光顯微鏡下觀察對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在明場(chǎng)（Bright field）和熒光（Fluorescence）下的圖片。

2.8?統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件中的t-檢驗(yàn)函數(shù)進(jìn)行組間差異分析，p<0.05為有顯著差異，p<0.01為有極顯著差異。

3?結(jié)果與討論

3.1?核酸適配體的篩選

篩選過(guò)程中親和力隨著篩選輪數(shù)的增加而上升，從第1輪的0.0150上升到第8輪的0.3765，上升了24.1倍（圖2），說(shuō)明隨著篩選進(jìn)行，結(jié)合到目標(biāo)菌上的核酸適配體逐步增加;最后的第7輪和第8輪的親和力已無(wú)顯著差異（p>0.05），說(shuō)明結(jié)合到兩個(gè)目標(biāo)菌哈維氏弧菌和溶藻弧菌上的核酸適配體數(shù)量已基本飽和。對(duì)第8輪的篩選產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，并利用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序獲得的序列進(jìn)行同源性分析，獲得同源樹(shù)（圖3），同源樹(shù)節(jié)點(diǎn)處的百分?jǐn)?shù)表示該節(jié)點(diǎn)左邊所涉及的核酸適配體之間的同源性比率。由圖3可見(jiàn)，在第8輪的篩選產(chǎn)物中，有相當(dāng)多的核酸適配體，其同源性已達(dá)到90%以上，有些甚至達(dá)到了100%，而最初篩選所用的隨機(jī)文庫(kù)中，其隨機(jī)ssDNA的同源性理論上是接近零的，這說(shuō)明隨著篩選進(jìn)行，篩選文庫(kù)中ssDNA的同源性在快速增加，適配體序列在一級(jí)結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)出明顯的收斂性。這也說(shuō)明，經(jīng)過(guò)8輪篩選，初始隨機(jī)文庫(kù)中的ssDNA呈現(xiàn)出明顯定向進(jìn)化趨勢(shì)，文庫(kù)中與目標(biāo)菌有較好親和力的核酸適配體得到了較好的富集。

有關(guān)病原菌核酸適配體的篩選已有文獻(xiàn)報(bào)道，但不同的研究針對(duì)不同的靶細(xì)菌，篩選效率差異較大。Marton等[14]以大腸桿菌為靶細(xì)菌，經(jīng)過(guò)12輪篩選，獲得的富集庫(kù)的親和力比初始文庫(kù)大約提高了6倍，Yang等[15]以沙門(mén)氏菌為靶目標(biāo)，經(jīng)過(guò)17輪篩選，富集庫(kù)對(duì)靶細(xì)菌的親和力提高了9倍以上，Yu等[16]以溶藻弧菌為靶目標(biāo)，經(jīng)過(guò)7～9輪篩選，其富集庫(kù)的親和力提高了約4倍。本研究則以溶藻弧菌和哈維氏弧菌作為共同靶細(xì)菌，經(jīng)過(guò)7～8輪篩選，獲得了親和力提高了24.1倍的富集庫(kù)，顯示出較高的篩選效率，篩選效率的提高可能與反篩和逐步增加的洗滌次數(shù)有關(guān)。在第4輪和第6輪分別增加了對(duì)嗜水氣單胞菌（A. hydrophila）和遲鈍愛(ài)德華氏菌（E. tarda）的反篩，較好去除了一些非特異性結(jié)合的ssDNA。同時(shí)，在第1和第2輪分別洗滌1次，第3輪洗滌2次，第4～8輪都分別洗滌3次，有效去除了一些親和力較弱的核酸適配體，從而使最終富集文庫(kù)中適配體的親和力得到較大提升。

3.2?共有核酸適配體的親和性和特異性

圖3的同源樹(shù)是根據(jù)適配體序列的同源性大小，采用DNAMAN軟件通過(guò)同源性分析得到的，其節(jié)點(diǎn)處的百分?jǐn)?shù)表示所涉及的核酸適配體之間的同源性比率。從圖3可見(jiàn)，同源性較高、適配體數(shù)量較多的主要有兩個(gè)群體，一個(gè)是同源性在87%以上、由14個(gè)核酸適配體組成的群體（C1、C17、C16、C39、C22、C34、C5、C8、C9、C42、C32、C23、C35、C24），另一個(gè)是同源性在92%以上、由13個(gè)適配體組成的群體（C14、C25、C48、C7、C37、C28、C29、C15、C27、C30、C6、C31、C38），其它適配體由于數(shù)量較少或同源性不夠高，缺乏代表性。因此，從有代表性的兩個(gè)群體中各選擇出一個(gè)核酸適配體，即適配體C14和C22，進(jìn)行親和性和特異性考察、親和常數(shù)的測(cè)定及其二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬。圖4顯示了這兩個(gè)共有核酸適配體對(duì)目標(biāo)菌的親和性和特異性，可見(jiàn)兩個(gè)核酸適配體對(duì)目標(biāo)菌哈維氏弧菌和溶藻弧菌的親和力都顯著高于非目標(biāo)菌嗜水氣單胞菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌（p<0.01），對(duì)哈維氏弧菌的親和力也顯著高于溶藻弧菌（p<0.01），說(shuō)明這兩個(gè)核酸適配體不僅能區(qū)分目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌，還能區(qū)分同為弧菌屬的哈維氏弧菌和溶藻弧菌，顯示出較好的親和性和特異性。

3.3?共有核酸適配體的親和常數(shù)及其二級(jí)結(jié)構(gòu)

兩個(gè)核酸適配體C14和C22對(duì)目標(biāo)菌哈維氏弧菌和溶藻弧菌的親和常數(shù)Kd及其擬合曲線如圖5所示，兩個(gè)核酸適配體對(duì)哈維氏弧菌的Kd都比溶藻弧菌低，說(shuō)明兩個(gè)適配體對(duì)哈維氏弧菌的親和力要更高，這與上述親和性和特異性的研究結(jié)果是一致的。

目前報(bào)道的核酸適配體的Kd多在pmol/L～nmol/L水平[17]。水產(chǎn)病原弧菌中，哈維氏弧菌核酸適配體的Kd在10～50 nmol/L之間[18]，副溶血弧菌核酸適配體的Kd在10～30 nmol/L之間[19]，溶藻弧菌適配體的Kd則在10～100 nmol/L之間[13，16，20]，而本研究得到的這兩個(gè)共有適配體，其對(duì)哈維氏弧菌和溶藻弧菌的Kd也都是介于10～100 nmol/L，與上述研究結(jié)果相近。

軟件模擬出的兩個(gè)核酸適配體（含兩端固定序列）的二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖6所示，以莖環(huán)和口袋結(jié)構(gòu)為主，莖以G-C配對(duì)為主。兩個(gè)適配體都含有6個(gè)封閉環(huán)，C14的封閉環(huán)較小，C22的封閉環(huán)較大，而且C22的3′端結(jié)構(gòu)要比C14更復(fù)雜些。越復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，其Kd通常會(huì)較小，親和力通常也較高，這可能是因?yàn)檩^復(fù)雜的結(jié)構(gòu)可能有較多的位點(diǎn)能與靶目標(biāo)結(jié)合，從而能夠提高其對(duì)靶目標(biāo)的親和力，這與本研究組前期的研究結(jié)果相近[18]。

3.4?熒光顯微鏡鑒定

如圖7所示，目標(biāo)菌哈維氏弧菌、溶藻弧菌和非目標(biāo)菌嗜水氣單胞菌、遲鈍愛(ài)德華氏菌、大腸桿菌自身均無(wú)明顯的熒光（如圖7的Vh，Va，Ah，Et，Ec），加入FAM熒光標(biāo)記的適配體C14或C22后，目標(biāo)菌哈維氏弧菌和溶藻弧菌均呈顯明顯的黃綠色熒光（如圖7的Vh+C14，Vh+C22，Va+C14，Va+C22），但非目標(biāo)菌嗜水氣單胞菌、遲鈍愛(ài)德華氏菌和大腸桿菌則未呈現(xiàn)出明顯的熒光（如圖7的Ah+C14，Ah+C22，Et+C14，Et+C22，Ec+C14，Ec+C22），說(shuō)明這兩個(gè)核酸適配體都能與哈維氏弧菌、溶藻弧菌特異結(jié)合，使這兩種目標(biāo)菌呈現(xiàn)出熒光，但對(duì)非目標(biāo)菌嗜水氣單胞菌、遲鈍愛(ài)德華氏菌和大腸桿菌則基本不結(jié)合，進(jìn)一步證明這兩個(gè)核酸適配體對(duì)哈維氏弧菌和溶藻弧菌有較好的親和性和特異性。

4?結(jié) 論

經(jīng)過(guò)8輪篩選，獲得了能識(shí)別哈維氏弧菌和溶藻弧菌的共有核酸適配體富集文庫(kù)，富集文庫(kù)的親和力提高了24倍以上。研究了兩個(gè)核酸適配體C14和C22的親和性和特異性，結(jié)果表明，兩個(gè)核酸適配體對(duì)哈維氏弧菌和溶藻弧菌都有較好的親和性和特異性，但對(duì)哈維氏弧菌的親和力要顯著高于溶藻弧菌。Kd的測(cè)定結(jié)果也表明，兩個(gè)核酸適配體對(duì)哈維氏弧菌的Kd都比溶藻弧菌低，說(shuō)明兩個(gè)適配體對(duì)哈維氏弧菌的親和力要更高。最后，用熒光顯微鏡進(jìn)一步證明了這兩個(gè)核酸適配體對(duì)哈維氏弧菌和溶藻弧菌都有較好的親和性和特異性，可用于這兩種弧菌的識(shí)別鑒定。利用核酸適配體進(jìn)行微生物的種屬鑒定具有快速、準(zhǔn)確、便捷的特點(diǎn)，但是由于核酸適配體是通過(guò)空間結(jié)構(gòu)來(lái)識(shí)別微生物的，因此當(dāng)微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)較大變化，影響到相應(yīng)識(shí)別位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)時(shí)，對(duì)核酸適配體的識(shí)別鑒定效果也會(huì)產(chǎn)生一定影響。

References

1?Rameshkumar P，Nazar A K A，Pradeep M A，Kalidas C，Jayakumar R ，Tamilmani G，Sakthivel M，Samal A K，Sirajudeen S，Venkatesan V，Nazeera B M. Lett. Appl. Microbiol.，2017，65（5）： 423-430

2?Austin B，Austin D A. Bacterial Fish Pathogens. Heidelberg： Springer，2012： 365-396

3?Selvin J，Lipton A P. Dis. Aquat.Org.，2003，57（1-2）： 147-150

4?Aguirre-Guzmán G，Ruíz H M，Ascencio F. Aquacult. Res.，2004，35（15）： 1395-1404

5?Schmidt U，Chmel H，Cobbs C. J. Clin. Microbiol.，1979，10（5）： 666-668

6?Austin B. Vet. Microbiol.，2010，140（3-4）： 310-317

7?Wei S，Zhao H，Xian Y Y，Hussain M A，Wu X Y. Diagn. Microbiol. Infect. Dis.，2014，79（2）： 115-118

8?Sawabe T，Kita T K，Thompson F L. J. Bacteriol.，2007，189 （21）： 7932-7936

9?Soontornworajit B，Wang Y. Anal. Bioanal. Chem.，2011，399（4）： 1591-1599

10?Farokhzad O C，Cheng J J，Teply B A，Sherifi I，Jon S，Kantoff P W ，Richie J P，Langer R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2006，103（16）： 6315-6320

11?Yazdian-Robati R，Arab A，Ramezani M，Abnous K，Taghdisi S M. Int. J. Pharm.，2017，529（1-2）： 44-54

12?YANG Ge，ZHU Chao，LIU Xiao-Hui，WANG Yong，QU Feng. Chinese J. Anal. Chem.，2018，46（10）： 1595-1603

楊 歌，朱 超，劉曉慧，王 勇，屈 鋒. 分析化學(xué)，2018，46（10）： 1595-1603

13?Tang X M，Zheng J，Yan Q P，Li Z B，Li Y B. Biotechnol. Lett.，2013，35（6）： 909-914

14?Marton S，Cleto F，Krieger M A，Cardoso J. PLoS One，2016，11（4）： e0153637

15?Yang M，Peng Z H，Ning Y，Chen Y Z，Zhou Q，Deng L. Sensors，2013，13： 6865-6881

16?Yu Q，Liu M Z，Su H F，Xiao H H，Wu S T，Qin X L，Li S Q，Mi H Z，Lu Z J，Shi D Q，Li P F. J. Fish Dis.，2019，42（6）： 851-858

17?Harleen K. BBA-Gen. Subjects，2018，1862： 2323-2329

18?ZHENG Jiang，HAO Ju-Min，SONG Lin-Sheng，LIU Rui. Progress in Biochemistry and Biophysics，2014，41（7）： 704-711

鄭 江，郝聚敏，宋林生，劉 瑞. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2014，41（7）： 704-711

19?Duan N，Wu S J，Chen X J，Huang Y K，Wang Z P. J. Agric. Food Chem.，?2012，60（16）： 4034-4038

20?Zheng J，Tang X M，Wu R X，Yan Q P，Tang H，Luo J W，Niu S F，Qu Y K，Sun L W. LWT-Food Sci. Technol.，2015，64（2）： 1138-1142