李林森 朱超 趙毅 楊歌 屈鋒

摘?要?毛細(xì)管電泳（CE）具有高分辨、快速分離、樣品用量小和無(wú)需固相介質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，是高效篩選核酸適配體的方法之一。然而，由于CE的進(jìn)樣量少，有限的核酸庫(kù)容量是否影響毛細(xì)管電泳-指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化（CE-SELEX）適配體的篩選效率，尚不明確。本研究以神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）為模式蛋白，考察了CE篩選中核酸庫(kù)容量對(duì)篩選效率的影響，以明確CE-SELEX方法的有效性。分別使用4個(gè)濃度（0.1、1、10和100 μmol/L）的初始核酸庫(kù)進(jìn)行適配體篩選，比較了初始庫(kù)與經(jīng)3輪篩選后的次級(jí)核酸庫(kù)的親和力。結(jié)果表明，4個(gè)核酸庫(kù)篩選輪次間庫(kù)親和力相近，且經(jīng)2輪篩選后均得到了微摩爾級(jí)別的核酸適配體。此外，用高濃度核酸庫(kù)篩選獲得的序列更具多樣性，但未能提升候選序列親和力。經(jīng)2輪篩選得到NSE的核酸適配體Seq qN-01，其與NSE復(fù)合物的解離常數(shù)（KD）為（4.72±0.15） μmol/L，并表現(xiàn)出很好的特異性。綜上，核酸庫(kù)容量會(huì)提高后續(xù)富集庫(kù)的序列多樣性，但對(duì)適配體篩選效率沒(méi)有顯著影響。

關(guān)鍵詞?神經(jīng)元特異性烯醇化酶;核酸庫(kù)容量;核酸適配體篩選;毛細(xì)管電泳-指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化

1?引 言

核酸適配體（Aptamer），又被稱為“化學(xué)抗體”，是通過(guò)指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化（SELEX）技術(shù)體外篩選獲得的寡核苷酸序列（單鏈DNA/ssDNA或RNA）。核酸適配體作為新型識(shí)別分子，不僅具有性質(zhì)穩(wěn)定、易合成和化學(xué)修飾、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，而且其識(shí)別的靶標(biāo)廣泛，包括金屬離子、有機(jī)分子、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、微生物、病毒等[1，2]。自1990年SELEX和Aptamer概念被提出以來(lái)[3，4]，核酸適配體已成為生物傳感、環(huán)境分析、疾病診斷、藥物遞送及醫(yī)學(xué)影像等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[5～9]。近三十年來(lái)，已有超過(guò)2700種核酸適配體被報(bào)道，但很多核酸適配體在實(shí)際應(yīng)用時(shí)的分子識(shí)別效果不佳，因而，核酸適配體的高效及有效篩選仍是影響其實(shí)際應(yīng)用的關(guān)鍵問(wèn)題之一[10～12]。目前，用于核酸適配體篩選的SELEX技術(shù)多達(dá)三十余種，多數(shù)SELEX技術(shù)需要8～15輪篩選，通常需要4～6周甚至數(shù)月之久，大大降低了核酸適配體的篩選效率;同時(shí)，多數(shù)SELEX技術(shù)在分離過(guò)程中引入介質(zhì)（磁珠、芯片等），也會(huì)造成核酸適配體的特異性缺失[11，13，14]。毛細(xì)管電泳（Capillary electrophoresis，CE）作為一種高分辨快速分離技術(shù)，可在溶液中分離和檢測(cè)核酸庫(kù)和靶標(biāo)-核酸復(fù)合物，篩選過(guò)程中無(wú)需固定靶標(biāo)或核酸庫(kù)，可大大縮短篩選周期，通常僅需1～4輪即可獲得適配體。此外，CE還可用于篩選過(guò)程中蛋白與核酸相互作用表征，次級(jí)核酸庫(kù)的親和力評(píng)價(jià)等[15～19]。常規(guī)的SELEX篩選使用的核酸庫(kù)容量約為1016個(gè)ssDNA序列，CE篩選時(shí)樣品用量少，所用的核酸庫(kù)容量約為1012個(gè)ssDNA序列[20，21]。有限的核酸庫(kù)容量是否會(huì)影響適配體的篩選效率是CE-SELEX的一個(gè)存疑點(diǎn)。

神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）是糖酵解烯醇化酶的細(xì)胞特異性同工酶，廣泛分布于神經(jīng)元和外周神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中，是目前小細(xì)胞肺癌的診斷、預(yù)后和后續(xù)治療中最可靠的腫瘤標(biāo)志物之一[22～24]。本研究以NSE為靶蛋白，建立了基于CE的NSE核酸適配體篩選方法，采用4個(gè)不同數(shù)量級(jí)濃度的初始核酸庫(kù)（0.1、1、10和100 μmol/L ssDNA庫(kù)）改變庫(kù)容量，以此研究核酸庫(kù)容量對(duì)適配體篩選效率的影響。經(jīng)過(guò)2輪CE篩選，優(yōu)選了NSE的核酸適配體Seq qN-01，其復(fù)合物的解離常數(shù)（KD）為（4.72±0.15） μmol/L，并利用CE-LIF法驗(yàn)證了其特異性，該適配體有望用于NSE的相關(guān)分析檢測(cè)。研究結(jié)果表明，從4個(gè)不同數(shù)量級(jí)濃度的初始核酸庫(kù)篩選的適配體序列與NSE的親和力相當(dāng)，說(shuō)明CE-SELEX在0.1～100 μmol/L濃度范圍內(nèi)初始核酸庫(kù)的濃度和容量差異對(duì)適配體篩選效率沒(méi)有顯著影響。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

Beckman P/ACETM MDQ（美國(guó)Beckman公司），配備激光誘導(dǎo)熒光（LIF）檢測(cè)器（488 nm激發(fā)光和520 nm發(fā)射光）;S1000TM Thermal Cycler PCR儀、電泳儀和電泳槽（美國(guó)Bio-Road公司）;T-green切膠儀（北京天根生化科技有限公司）;Illumina-Hiseq平臺(tái)測(cè)序（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

熔融石英毛細(xì)管（75 μm內(nèi)徑，有效長(zhǎng)度/總長(zhǎng)：40.2 cm/50.2 cm，河北邯鄲鑫諾光纖色譜有限公司）;NSE（武漢云克隆科技股份有限公司）;80 nt熒光標(biāo)記核酸庫(kù)（5-FAM-AGCA GCAC AGAG GTCA GATG-40N-CCTA TGCG TGCT ACCG TGAA-3（兩端為20 nt引物區(qū)固定序列，中間為40 nt隨機(jī)序列））、上游引物P1（5-AGCA GCAC AGAG GTCA GATG-3）、熒光標(biāo)記的上游引物5-FAM-P1（ FAM-5-AGCA GCAC AGAG GTCA GATG-3）、下游引物P2（5-TTCA CGGT AGCA CGCA TAGG-3（生工生物工程（上海）股份有限公司）;溶菌酶適配體（80 nt長(zhǎng)度的AChE-L和60 nt長(zhǎng)度的AChE-M）;2×Taq Plus PCR Master Mix（天根生化科技有限公司）;Na2B4O7·10H2O、H3BO3、NaOH、H3PO4、Tris-HCl（分析純，北京化工廠）;實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水（ddH2O）。

適配體篩選用溶液：A：25 mmol/L Tris base，192 mmol/L Glycine，5 mmol/L K2HPO4，1 mmol/L MgCl2，2.7 mmol/L KCl，40 mmol/L NaCl（TGK，pH 8.3）;B：25 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L MgCl2，2.7 mmol/L KCl，40 mmol/L NaCl（Tris-HCl，pH 7.4）;C：8.1 mmol/L Na2HPO4，1.1 mmol/L KH2PO4，1 mmol/L MgCl2，2.7 mmol/L KCl，40 mmol/L NaCl（PBS，pH 7.4）;D：20 mmol/L HEPES，150 mmol/L NaCl（HEPES，pH 7.5）。上述溶液均用ddH2O配制，并經(jīng) 0.22 μm濾膜過(guò)濾后使用。

2.2?實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1?蛋白和核酸庫(kù)溶液配制?NSE使用ddH2O配制成10 μmol/L儲(chǔ)備液，80℃保存。核酸庫(kù)配制成100 μmol/L溶液，使用前在94℃變性5 min，緩慢冷卻至室溫，再稀釋至所需濃度。

2.2.2?毛細(xì)管電泳分離分析?將NSE和核酸庫(kù)在PCR管中混勻，37℃水浴孵育30 min。CE分析條件：50 mmol/L硼酸-硼砂緩沖液（pH 8.7），分離電壓20 kV，溫度25℃，LIF檢測(cè)，0.5 psi（1 psi=6.895 kPa）進(jìn)樣10 s。將所需復(fù)合物收集到含50 μL緩沖液的PCR管中，用于后續(xù)PCR。每次CE運(yùn)行間分別用0.1 mol/L NaOH、ddH2O、H3BO3/Na2B4O7溶液沖洗毛細(xì)管3 min。新毛細(xì)管使用前，用1 mol/L NaOH、0.1 mol/L NaOH和ddH2O各沖洗30 min。

2.2.3?核酸序列分析與親和力表征?PCR擴(kuò)增包含對(duì)稱PCR和不對(duì)稱PCR兩個(gè)步驟，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化，具體步驟參考文獻(xiàn)[25]。M-fold軟件用于預(yù)測(cè)候選核酸適配體序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)。親和力KD計(jì)算參考NECEEM方法，計(jì)算公式如下[16，26]：

其中，[P]0和[DNA]0分別是平衡體系中蛋白質(zhì)和核酸的總濃度;A1是游離核酸的峰面積，A2是蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物的峰面積，A3是復(fù)合物解離區(qū)的峰面積。

3?結(jié)果與討論

3.1?NSE-ssDNA復(fù)合物形成和驗(yàn)證

將1 μmol/L核酸庫(kù)與等體積水混合，進(jìn)行CE分析，7.5 min處出現(xiàn)明顯的核酸庫(kù)峰。加入NSE蛋白，核酸庫(kù)峰降低，并在3.5 min處出現(xiàn)新峰，此峰隨NSE濃度增加（2.5、5和10 μmol/L）而增大（圖1A），是NSE-ssDNA復(fù)合物。這也說(shuō)明NSE與核酸庫(kù)中的一些核酸序列之間發(fā)生相互作用，并能形成穩(wěn)定的復(fù)合物。

進(jìn)一步考察了溶液對(duì)復(fù)合物形成的影響。分別用ddH2O、TGK、Tris-HCl、PBS、HEPES溶液配制核酸庫(kù)，使核酸庫(kù)與NSE在上述溶液中孵育后進(jìn)行CE分析。由圖1B可見，5種溶液中均可形成NSE-ssDNA復(fù)合物，2.5 min處有明顯的復(fù)合物峰。其中，ddH2O和TGK溶液中產(chǎn)生的復(fù)合物峰較小;而Tris-HCl、PBS和HEPES溶液中產(chǎn)生的復(fù)合物峰高比ddH2O中提高約4倍，表明Tris-HCl、PBS和HEPES溶液更有利于NSE-ssDNA復(fù)合物的形成和穩(wěn)定。HEPES溶液中產(chǎn)生的復(fù)合物峰最大，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇HEPES為孵育緩沖液。

3.2?不同濃度核酸庫(kù)的篩選效率比較

將4個(gè)濃度的初始核酸庫(kù)（0.1、1、10和100 μmol/L）分別與5 μmol/L NSE混合孵育，進(jìn)行CE分離。收集NSE-ssDNA復(fù)合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再純化后，制成次級(jí)核酸庫(kù)，完成1輪篩選，此過(guò)程可重復(fù)進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)多輪篩選。通過(guò)CE-LIF測(cè)定每輪核酸庫(kù)與NSE復(fù)合物的親和力，監(jiān)測(cè)每輪次級(jí)核酸庫(kù)的親和力，評(píng)估核酸庫(kù)的富集程度，直至次級(jí)核酸庫(kù)的親和力不再提升時(shí)，停止篩選。

由圖2A可見，較低濃度的初始核酸庫(kù)ssDNA0（0.1和1 μmol/L）中加入NSE，只有很小的復(fù)合物峰出現(xiàn)，而10和100 μmol/L核酸庫(kù)中加入NSE，復(fù)合物峰明顯增大。100 μmol/L核酸庫(kù)產(chǎn)生的復(fù)合物峰面積約為前者的10倍，說(shuō)明相同濃度的NSE在高濃度的核酸庫(kù)中結(jié)合了更多的核酸。將此復(fù)合物收集、擴(kuò)增、純化，得到第1輪篩選后的次級(jí)核酸庫(kù)ssDNA1。繼續(xù)第2輪篩選，得到ssDNA2。對(duì)4個(gè)濃度的初始核酸庫(kù)分別進(jìn)行2輪篩選，在2輪篩選得到的次級(jí)核酸庫(kù)ssDNA2中分別加入NSE。由圖2B可見，4個(gè)次級(jí)庫(kù)與NSE形成的復(fù)合物峰都很小，特別是100和0.1 μmol/L形成的復(fù)合物峰沒(méi)有明顯差異。4個(gè)濃度的初始核酸庫(kù)（濃度相差104倍）經(jīng)過(guò)2輪篩選后，次級(jí)核酸庫(kù)ssDNA2與NSE的結(jié)合已無(wú)明顯差異。說(shuō)明初始核酸庫(kù)的濃度并不決定次級(jí)核酸庫(kù)中與NSE結(jié)合的核酸序列的數(shù)量。這也進(jìn)一步說(shuō)明，高濃度的初始核酸庫(kù)中可能有大部分核酸序列與NSE的結(jié)合較弱，形成的復(fù)合物也不穩(wěn)定。經(jīng)過(guò)兩輪篩選，與NSE結(jié)合弱的核酸序列幾乎都被去除。由于核酸庫(kù)是各種核酸序列的混合，核酸庫(kù)合成時(shí)，中間隨機(jī)區(qū)的序列具有不確定性。因此，高濃度的核酸庫(kù)中并不能確定含有更多可與NSE強(qiáng)結(jié)合的核酸序列，高濃度和低濃度核酸庫(kù)中含有的強(qiáng)結(jié)合核酸序列可能是恒定的，因此，核酸庫(kù)的容量并不決定適配體的篩選效率。

為定量評(píng)價(jià)核酸庫(kù)與NSE的結(jié)合強(qiáng)弱，分別測(cè)定4個(gè)初始核酸庫(kù)ssDNA0與NSE的解離常數(shù)KD。由圖3A可見，初始核酸庫(kù)ssDNA0的KD≈40 μmol/L，經(jīng)過(guò)3輪篩選后，再測(cè)定3個(gè)次級(jí)庫(kù)ssDNA1、ssDNA2和ssDNA3的KD。經(jīng)過(guò)1輪篩選后，次級(jí)核酸庫(kù)ssDNA1的KD明顯降低，說(shuō)明其親和力明顯提升，初始核酸庫(kù)中結(jié)合力強(qiáng)的序列得到富集。經(jīng)第2輪和第3輪篩選后的KD值變化不大，平均KD≈10 μmol/L。4個(gè)濃度的初始核酸庫(kù)經(jīng)過(guò)篩選后得到的次級(jí)庫(kù)KD值在同一數(shù)量級(jí)（圖3A），說(shuō)明不同濃度的核酸庫(kù)經(jīng)過(guò)兩輪CE篩選后，其與NSE結(jié)合的親和力相當(dāng)。

值得注意的是，高濃度（100 μmol/L）的初始核酸庫(kù)經(jīng)第1輪篩選后，次級(jí)核酸庫(kù)的親和力反而低于其它濃度的核酸庫(kù)（KD≈20 μmol/L）?？赡艿脑蚴?，高濃度核酸庫(kù)形成的復(fù)合物量大，復(fù)合物中含有的不均一核酸序列也多，而PCR存在的偏性擴(kuò)增可能導(dǎo)致強(qiáng)結(jié)合的序列未能成比例地有效擴(kuò)增，故高濃度次級(jí)庫(kù)的親和力并未達(dá)預(yù)期。但經(jīng)過(guò)第2輪、第3輪篩選后，大部分核酸序列去除，這種擴(kuò)增所致的差異已不明顯。此外，與第2輪篩選相比，第3輪篩選并不能使KD進(jìn)一步提升，甚至降低，這說(shuō)明過(guò)多的篩選輪數(shù)不僅造成時(shí)間和費(fèi)用的浪費(fèi)，而且多次PCR過(guò)程可能引入較大的堿基錯(cuò)配、偏性擴(kuò)增等誤差。因此，較多的篩選輪次并不能明顯提高核酸庫(kù)的平均親和力。

第2輪篩選后，收集的復(fù)合物的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖如圖3B所示，4個(gè)濃度的核酸庫(kù)產(chǎn)生的復(fù)合物的擴(kuò)增產(chǎn)物在50～100 bp區(qū)間內(nèi)均有清晰的、亮度相近的DNA條帶，且沒(méi)有多余雜帶。這也說(shuō)明4個(gè)核酸庫(kù)經(jīng)過(guò)2輪篩選后，其復(fù)合物的PCR產(chǎn)物量相當(dāng)。因此，在本研究選擇的濃度范圍內(nèi)，初始核酸庫(kù)的濃度不會(huì)影響后續(xù)產(chǎn)生的適配體的數(shù)量。

3.3?高通量測(cè)序與數(shù)據(jù)分析

收集2輪篩選的ssDNA2-NSE復(fù)合物，PCR擴(kuò)增后，經(jīng)Illumina-Miseq高通量測(cè)序，使用Fastaptamer軟件對(duì)ssDNA2序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。4個(gè)核酸庫(kù)中篩選出的核酸序列測(cè)序后的總序列數(shù)分別為179355、185306、166185和171142，總量相差不大，但不同序列的數(shù)量（序列多樣性）有差異。100 μmol/L核酸庫(kù)，篩選后的序列多樣性為總序列數(shù)的93.95%，而0.1 μmol/L核酸庫(kù)，序列多樣性占78.33%。這也說(shuō)明從高濃度初始核酸庫(kù)篩選得到的次級(jí)庫(kù)，其核酸序列的多樣性可能更好，但核酸庫(kù)中的序列多樣性與篩選序列的親和力沒(méi)有必然相關(guān)性。圖2和圖3的定性和定量分析結(jié)果也表明核酸庫(kù)濃度對(duì)所篩選序列的親和力沒(méi)有顯著影響。

3.4?候選序列的選擇及親和力分析

對(duì)每個(gè)核酸庫(kù)中2輪篩選后的ssDNA2進(jìn)行高通量測(cè)序，從大量核酸序列中選擇10條核酸序列作為候選序列。這10條候選序列分別是每個(gè)次級(jí)庫(kù)中出現(xiàn)頻率最高的兩條序列（Seq qN-01～08）、一條隨機(jī)序列（Seq qN-09）、4個(gè)庫(kù)中的共有序列（Seq qN-10）。圖4為M-fold軟件給出序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)。10條候選序列中Seq qN-01表現(xiàn)出最佳的親和力，KD=（4.72±0.15） μmol/L;其余候選序列的KD≈6.5 μmol/L;這些序列表現(xiàn)出相近的親和力（μmol級(jí)）（表2），與圖3A核酸庫(kù)的總親和力結(jié)果吻合。其中，Seq qN-10為4個(gè)核酸庫(kù)中的共同序列，出現(xiàn)的頻率和比率均最高，測(cè)定其KD=（7.84±1.31） μmol/L;而隨機(jī)序列Seq qN-09的KD=（8.51±1.67） μmol/L，與Seq qN-10親和力相近。此結(jié)果也與文獻(xiàn)[27]一致，即CE篩選中序列出現(xiàn)的頻次與其親和力強(qiáng)弱之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)差異。

3.5?適配體特異性分析

以親和力最優(yōu)的Seq qN-01為候選適配體，驗(yàn)證其對(duì)NSE蛋白結(jié)合的特異性。將Seq qN-01分別與NSE及血清相關(guān)蛋白（細(xì)胞色素C、血紅蛋白、人凝血酶、免疫球蛋白G（IgG）、人血清白蛋白（HSA））混合孵育后，進(jìn)行CE分析。由圖5A可見，Seq qN-01與NSE的混合物在2.6 min有明顯的復(fù)合物峰，而與其它5種蛋白的混合物沒(méi)有復(fù)合物峰，說(shuō)明篩選的Seq qN-01對(duì)NSE具有選擇性識(shí)別能力。以兩條溶菌酶的適配體序列（AChE-L和AChE-M）為對(duì)照，它們是與NSE不相關(guān)的核酸序列，故與NSE沒(méi)有相互作用，圖5B中沒(méi)有復(fù)合物峰。而Seq qN-01與NSE可形成明顯的復(fù)合物峰。當(dāng)Seq qN-01與溶菌酶的兩條適配體序列混合，其中加入NSE，仍然可見復(fù)合物峰，表明只有Seq qN-01對(duì)NSE具有特異性識(shí)別。

4?結(jié) 論

基于CE-SELEX建立了篩選NSE適配體的方法，使用4種不同濃度的初始核酸庫(kù)（0.1、1、10和100 μmol/L），通過(guò)比較3輪篩選的庫(kù)間親和力、序列多樣性以及篩選后得到的序列親和力，研究核酸庫(kù)容量對(duì)適配體篩選效率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，盡管濃度較高的大容量核酸庫(kù)中含有更多的ssDNA序列，但從中篩選的核酸適配體序列親和力與容量小的核酸庫(kù)中篩選的序列親和力相當(dāng)。說(shuō)明在CE-SELEX中核酸庫(kù)容量對(duì)適配體篩選效率并沒(méi)有顯著影響，進(jìn)一步說(shuō)明ssDNA庫(kù)中序列的多樣性不是獲得高親和力適配體的關(guān)鍵，而能夠獲得有識(shí)別功能的核酸序列是成功篩選的關(guān)鍵。盡管CE-SELEX中所用的核酸庫(kù)容量小于其它SELEX方法，但僅需2輪篩選即可獲到NSE的高親和力、高特異性的適配體Seq qN-01（KD=（4.72±0.15） μmol/L），其親和力和特異性令人滿意。

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