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        一種新的柱前衍生RP-HPLC法測定漁產(chǎn)品中的生物胺

        2020-05-09 10:09:25李素媛喻璽黃龍
        湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年1期
        關(guān)鍵詞:高效液相色譜

        李素媛 喻璽 黃龍

        摘要:采用一種新的柱前衍生-反高效液相色譜法對15種水產(chǎn)品中的8種生物胺進(jìn)行檢測。利用C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱,以乙腈和水混合液進(jìn)行梯度洗脫,流速為0.8 mL/min,在254 nm波長下進(jìn)行生物胺含量的測定。結(jié)果表明,在1.0~100 mg/L濃度范圍內(nèi),8種生物胺的分離呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)(R2≥0.998),方法的檢出限及定量限均低于國標(biāo)方法,加標(biāo)平均回收率為90%~110%,該方法操作簡單,衍生物穩(wěn)定,雜質(zhì)少,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,能對魚及魚類制品中的生物胺進(jìn)行檢測。

        關(guān)鍵詞:水產(chǎn)品;生物胺;高效液相色譜

        中圖分類號:TS254.7 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

        文章編號:0439-8114(2020)01-0145-04

        DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.01.033 ? ? ? ? ? 開放科學(xué)(資源服務(wù))標(biāo)識碼(OSID):

        Abstract: A new pre-column derivatization and reversed high performance liquid chromatography (RP-HPLC) was used to detect 8 biogenic amines in 15 kinds of aquatic products.,8 biogenic amines could be separated by a new precolumn derivatization method. The results showed that in the range of 1.0 to 100 mg/L, 8 biogenic amines showed a good linear correlation(R2≥0.998), the detection limit and quantitative limit of the method were lower than that of the national standard method. The average recovery rate of the added standard was 90%~110%. The method was simple to operate,derivatives are stable, few impurity, accurate and reliable results, can be used to detect biological amines in fish and dried fish products.

        Key words: aquatic products; biogenic amines; high performance liquid chromatography

        生物胺是一類含氨基且具有生物活性的低分子有機(jī)化合物,過量的生物胺會引起頭疼、低/高血壓、腹瀉和嘔吐等,嚴(yán)重甚至?xí)氯怂劳?。水產(chǎn)品及其制品在貯存運(yùn)輸過程更容易產(chǎn)生生物胺,因此生物胺含量的測定對漁產(chǎn)品及其制品的質(zhì)量安全控制具有重要的意義。

        《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中生物胺的測定》(GB 5009.208-2016)中第一法——液相色譜法是目前通用的同時(shí)測定水產(chǎn)品及其制品中8種生物胺的方法。該方法采用三氯乙酸提取,正己烷去脂肪,三氯甲烷-正丁醇萃取凈化,丹磺酰氯作衍生劑,乙醚萃取衍生物,C18色譜柱分離,高效液相色譜-紫外檢測器檢測,內(nèi)標(biāo)法定量。丹磺酰氯衍生劑價(jià)格較貴,樣品提取凈化方法復(fù)雜,整個檢測過程耗時(shí)較長,而且衍生物穩(wěn)定性差,需要在規(guī)定的時(shí)間類檢測完畢,對于大批量樣品的檢測存在局限性。本研究在國標(biāo)方法的基礎(chǔ)上,采用4-氟-3-硝基三氟甲苯(FNBT)作為衍生劑,N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)為催化劑,同時(shí)對樣品的前處理過程改進(jìn)優(yōu)化,對水產(chǎn)品中的8種生物胺進(jìn)行檢測。與國標(biāo)方法相比,該方法縮短時(shí)間,操作簡單,衍生物穩(wěn)定,雜質(zhì)少,結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

        1 ?材料與方法

        1.1 ? 材料

        1.1.1 ?試驗(yàn)樣品 ?市售各種魚及魚干樣品,購自超市及菜市場。

        1.1.2 ?試劑 ?組胺、酪胺、尸胺、腐胺、β-苯乙胺、色胺、精胺、亞精胺標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%以上),Sigma公司;1,7-二氨基庚烷,內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%以上),4-氟-3-硝基三氟甲苯(FNBT)(純度99%),N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)(純度99%),上海安譜科學(xué)儀器有限公司;色譜純乙腈、甲醇、乙酸乙酯、乙酸胺,Merck公司;優(yōu)級純鹽酸、硼酸、四硼酸鈉,亞鐵氰化鉀、乙酸鋅等,國藥集團(tuán)。GB 5009.208-2016標(biāo)準(zhǔn)中第一法高效液相色譜法所需試劑按國標(biāo)要求購買并配制。

        1.1.3 ?儀器 ?2695型高效液相色譜儀(Waters公司);超純水處理器(Milli-Q公司);P-12型平行濃縮儀(BUCHI公司);漩渦混合器(Talboys公司);CF-16KH型落地冷凍離心機(jī)(日立(中國)有限公司);PHSJ-4F 型pH酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠);TH2-82型水浴恒溫振蕩器(常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司)。

        1.2 ?方法

        1.2.1 ?標(biāo)準(zhǔn)溶液和試劑的配制

        1)標(biāo)準(zhǔn)生物胺溶液。準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品100 mg,用0.1 mol/L鹽酸溶解,并定容至100 mL,配成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,分別準(zhǔn)確移取以上標(biāo)準(zhǔn)儲備液1 mL混合均勻,用0.1 mol/L鹽酸定容至10 mL,再用0.1 mol/L鹽酸稀釋成最終濃度分別為1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液,4 ℃避光保存。

        2)4-氟-3-硝基三氟甲苯(FNBT)衍生劑。用甲醇稀釋20倍,室溫保存。

        3)內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確稱取內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品100 mg,用0.1 mol/L鹽酸溶解,并定容至10 mL,配成濃度為10.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,置于-20 ℃保存。吸取1.0 mL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL容量瓶中,用0.1 mol/L鹽酸定容到刻度,配制成1.0 mg/mL的中間液,再吸取1.0 mL中間液于10 mL容量瓶中,用0.1 mol/L鹽酸定容到刻度,混勻,作為內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用溶液,濃度為100 mg/L。

        1.2.2 ?樣品的提取與衍生

        1)樣品提取。準(zhǔn)確稱取5.0 g絞碎的樣品于50 mL離心管中,加入0.5 mL內(nèi)標(biāo)中間液(濃度為1.0 mg/mL),與樣品充分混合,加入20 mL的0.1 mol/L鹽酸溶液,振蕩提取30 min,加入5 mL亞鐵氰化鉀溶液(92 g/L),5 mL乙酸鋅溶液(183 g/L),混均后離心10 min,轉(zhuǎn)移上層清液至50 mL容量瓶中,加入20 mL的0.1 mol/L鹽酸溶液重復(fù)提取1次,合并上清液,用0.1 mol/L鹽酸溶液定容至50 mL。

        2)樣品衍生。準(zhǔn)確移取1 mL試樣提取液于15 mL具塞離心管中,用0.1 mol/L Na2B4O7緩沖液調(diào)節(jié)pH 9.5,加入2.0 mL 4-氟-3-硝基三氟甲苯(FNBT),20 uL N,N-二異丙基乙胺(DIPEA),置于恒溫振蕩水浴鍋(60 ℃,30 min),取出后加入20 μL 2.0 mol/L鹽酸溶液中斷反應(yīng),室溫反應(yīng)5 min,用5 mL乙酸乙酯提取,渦旋振蕩后離心10 min,收集上層有機(jī)層,重復(fù)提取3次,合并提取液于平行濃縮儀中旋干,殘?jiān)尤?.0 mL甲醇,渦旋溶解,過0.45 μm濾膜,液相色譜儀檢測。

        3)標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生。分別移取1 mL生物胺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,置于15 mL具塞離心管中,依次加入100 μL內(nèi)標(biāo)溶液(100 mg/L),以下操作同試樣的衍生步驟。

        1.2.3 ?色譜條件 ?色譜柱:Waters C18色譜柱(粒徑5 μm,4.6 mm×250 mm)紫外檢測器,波長254 nm,進(jìn)樣量:20 μL,柱溫:35 ℃,流動相A為90%乙腈/10%(含0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸銨溶液),流動相B為10%乙腈/90%(含0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸胺溶液),流速0.8 mL/min。梯度洗脫程序見表1。

        2 ?結(jié)果與分析

        2.1 ?標(biāo)準(zhǔn)品與樣品色譜圖

        標(biāo)準(zhǔn)品與試劑樣品色譜分別如圖1、圖2。

        2.2 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

        水產(chǎn)品的國標(biāo)檢出限8種生物胺均為20 mg/kg,定量限均為50 mg/kg,以信噪比(S/N)大于3作為檢出限的判斷標(biāo)準(zhǔn),以信噪比(S/N)大于10作為定量限的判斷標(biāo)準(zhǔn),本研究方法所測定的8種生物胺的檢出限及定量限均低于國標(biāo),說明該檢測方法靈敏度滿足要求,兩種方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及線性見表2。

        2.3 ?精密度及加標(biāo)回收率

        對濃度為10.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)生物胺混合溶液,采用國標(biāo)法及本研究方法所得衍生物,連續(xù)6次進(jìn)樣,各組分的峰面積及標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。同一個樣品制樣均勻后,用10.0、15.0 mg/L兩個濃度的混合生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收,兩種方法加標(biāo)回收率見表4。從表3、表4可以看出,所測各項(xiàng)生物胺的精密度指標(biāo)RSD均在5%以內(nèi),加標(biāo)回收率在90%~110%之間,說明與國標(biāo)方法相比,該方法也是可靠的。

        2.4 ?樣品檢測

        本研究方法對市售15種魚、魚干及魚制品中生物胺的種類及其含量進(jìn)行檢測結(jié)果見表5。由表5可知,新鮮魚類各種生物胺含量較低,主要測出組分為組胺、腐胺、酪胺、尸胺,其他生物胺組分含量較低或未檢出。經(jīng)過急速真空干燥加工處理的魚干制品,如清江風(fēng)味魚各種成品等魚類制品生物胺含量也較低,市售散裝魚干組胺、腐胺、尸胺等含量較高。

        3 ?結(jié)論

        本研究采用新的衍生方法,改進(jìn)了樣品前處理,同時(shí)測定水產(chǎn)品中8種生物胺。該方法穩(wěn)定、操作簡單、準(zhǔn)確快速,對有效控制水產(chǎn)品質(zhì)量大有幫助。目前,消費(fèi)者及監(jiān)督機(jī)構(gòu)對漁產(chǎn)品及其制品控制項(xiàng)目多聚焦在獸藥殘留、抗生素殘留及防腐劑上,偶爾監(jiān)管部門會對組胺進(jìn)行檢測。從本研究檢測結(jié)果可知,對水產(chǎn)品的新鮮程度也應(yīng)加強(qiáng)控制和安全監(jiān)督,對其他生物胺組分也應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測。

        參考文獻(xiàn):

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