李素媛 喻璽 黃龍

摘要：采用一種新的柱前衍生-反高效液相色譜法對15種水產(chǎn)品中的8種生物胺進(jìn)行檢測。利用C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈和水混合液進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.8 mL/min，在254 nm波長下進(jìn)行生物胺含量的測定。結(jié)果表明，在1.0～100 mg/L濃度范圍內(nèi)，8種生物胺的分離呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)（R2≥0.998），方法的檢出限及定量限均低于國標(biāo)方法，加標(biāo)平均回收率為90%～110%，該方法操作簡單，衍生物穩(wěn)定，雜質(zhì)少，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，能對魚及魚類制品中的生物胺進(jìn)行檢測。

關(guān)鍵詞：水產(chǎn)品;生物胺;高效液相色譜

中圖分類號：TS254.7 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）01-0145-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.01.033 ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： A new pre-column derivatization and reversed high performance liquid chromatography （RP-HPLC） was used to detect 8 biogenic amines in 15 kinds of aquatic products.，8 biogenic amines could be separated by a new precolumn derivatization method. The results showed that in the range of 1.0 to 100 mg/L， 8 biogenic amines showed a good linear correlation（R2≥0.998）， the detection limit and quantitative limit of the method were lower than that of the national standard method. The average recovery rate of the added standard was 90%～110%. The method was simple to operate，derivatives are stable， few impurity， accurate and reliable results， can be used to detect biological amines in fish and dried fish products.

Key words： aquatic products; biogenic amines; high performance liquid chromatography

生物胺是一類含氨基且具有生物活性的低分子有機(jī)化合物，過量的生物胺會引起頭疼、低/高血壓、腹瀉和嘔吐等，嚴(yán)重甚至?xí)氯怂劳?。水產(chǎn)品及其制品在貯存運(yùn)輸過程更容易產(chǎn)生生物胺，因此生物胺含量的測定對漁產(chǎn)品及其制品的質(zhì)量安全控制具有重要的意義。

《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中生物胺的測定》（GB 5009.208-2016）中第一法——液相色譜法是目前通用的同時(shí)測定水產(chǎn)品及其制品中8種生物胺的方法。該方法采用三氯乙酸提取，正己烷去脂肪，三氯甲烷-正丁醇萃取凈化，丹磺酰氯作衍生劑，乙醚萃取衍生物，C18色譜柱分離，高效液相色譜-紫外檢測器檢測，內(nèi)標(biāo)法定量。丹磺酰氯衍生劑價(jià)格較貴，樣品提取凈化方法復(fù)雜，整個檢測過程耗時(shí)較長，而且衍生物穩(wěn)定性差，需要在規(guī)定的時(shí)間類檢測完畢，對于大批量樣品的檢測存在局限性。本研究在國標(biāo)方法的基礎(chǔ)上，采用4-氟-3-硝基三氟甲苯（FNBT）作為衍生劑，N，N-二異丙基乙胺（DIPEA）為催化劑，同時(shí)對樣品的前處理過程改進(jìn)優(yōu)化，對水產(chǎn)品中的8種生物胺進(jìn)行檢測。與國標(biāo)方法相比，該方法縮短時(shí)間，操作簡單，衍生物穩(wěn)定，雜質(zhì)少，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

1 ?材料與方法

1.1 ? 材料

1.1.1 ?試驗(yàn)樣品 ?市售各種魚及魚干樣品，購自超市及菜市場。

1.1.2 ?試劑 ?組胺、酪胺、尸胺、腐胺、β-苯乙胺、色胺、精胺、亞精胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%以上），Sigma公司;1，7-二氨基庚烷，內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%以上），4-氟-3-硝基三氟甲苯（FNBT）（純度99%），N，N-二異丙基乙胺（DIPEA）（純度99%），上海安譜科學(xué)儀器有限公司;色譜純乙腈、甲醇、乙酸乙酯、乙酸胺，Merck公司;優(yōu)級純鹽酸、硼酸、四硼酸鈉，亞鐵氰化鉀、乙酸鋅等，國藥集團(tuán)。GB 5009.208-2016標(biāo)準(zhǔn)中第一法高效液相色譜法所需試劑按國標(biāo)要求購買并配制。

1.1.3 ?儀器 ?2695型高效液相色譜儀（Waters公司）;超純水處理器（Milli-Q公司）;P-12型平行濃縮儀（BUCHI公司）;漩渦混合器（Talboys公司）;CF-16KH型落地冷凍離心機(jī)（日立（中國）有限公司）;PHSJ-4F 型pH酸度計(jì)（上海雷磁儀器廠）;TH2-82型水浴恒溫振蕩器（常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?標(biāo)準(zhǔn)溶液和試劑的配制

1）標(biāo)準(zhǔn)生物胺溶液。準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，用0.1 mol/L鹽酸溶解，并定容至100 mL，配成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別準(zhǔn)確移取以上標(biāo)準(zhǔn)儲備液1 mL混合均勻，用0.1 mol/L鹽酸定容至10 mL，再用0.1 mol/L鹽酸稀釋成最終濃度分別為1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，4 ℃避光保存。

2）4-氟-3-硝基三氟甲苯（FNBT）衍生劑。用甲醇稀釋20倍，室溫保存。

3）內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確稱取內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，用0.1 mol/L鹽酸溶解，并定容至10 mL，配成濃度為10.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于-20 ℃保存。吸取1.0 mL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸定容到刻度，配制成1.0 mg/mL的中間液，再吸取1.0 mL中間液于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸定容到刻度，混勻，作為內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，濃度為100 mg/L。

1.2.2 ?樣品的提取與衍生

1）樣品提取。準(zhǔn)確稱取5.0 g絞碎的樣品于50 mL離心管中，加入0.5 mL內(nèi)標(biāo)中間液（濃度為1.0 mg/mL），與樣品充分混合，加入20 mL的0.1 mol/L鹽酸溶液，振蕩提取30 min，加入5 mL亞鐵氰化鉀溶液（92 g/L），5 mL乙酸鋅溶液（183 g/L），混均后離心10 min，轉(zhuǎn)移上層清液至50 mL容量瓶中，加入20 mL的0.1 mol/L鹽酸溶液重復(fù)提取1次，合并上清液，用0.1 mol/L鹽酸溶液定容至50 mL。

2）樣品衍生。準(zhǔn)確移取1 mL試樣提取液于15 mL具塞離心管中，用0.1 mol/L Na2B4O7緩沖液調(diào)節(jié)pH 9.5，加入2.0 mL 4-氟-3-硝基三氟甲苯（FNBT），20 uL N，N-二異丙基乙胺（DIPEA），置于恒溫振蕩水浴鍋（60 ℃，30 min），取出后加入20 μL 2.0 mol/L鹽酸溶液中斷反應(yīng)，室溫反應(yīng)5 min，用5 mL乙酸乙酯提取，渦旋振蕩后離心10 min，收集上層有機(jī)層，重復(fù)提取3次，合并提取液于平行濃縮儀中旋干，殘?jiān)尤?.0 mL甲醇，渦旋溶解，過0.45 μm濾膜，液相色譜儀檢測。

3）標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生。分別移取1 mL生物胺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，置于15 mL具塞離心管中，依次加入100 μL內(nèi)標(biāo)溶液（100 mg/L），以下操作同試樣的衍生步驟。

1.2.3 ?色譜條件 ?色譜柱：Waters C18色譜柱（粒徑5 μm，4.6 mm×250 mm）紫外檢測器，波長254 nm，進(jìn)樣量：20 μL，柱溫：35 ℃，流動相A為90%乙腈/10%（含0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸銨溶液），流動相B為10%乙腈/90%（含0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸胺溶液），流速0.8 mL/min。梯度洗脫程序見表1。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?標(biāo)準(zhǔn)品與樣品色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)品與試劑樣品色譜分別如圖1、圖2。

2.2 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

水產(chǎn)品的國標(biāo)檢出限8種生物胺均為20 mg/kg，定量限均為50 mg/kg，以信噪比（S/N）大于3作為檢出限的判斷標(biāo)準(zhǔn)，以信噪比（S/N）大于10作為定量限的判斷標(biāo)準(zhǔn)，本研究方法所測定的8種生物胺的檢出限及定量限均低于國標(biāo)，說明該檢測方法靈敏度滿足要求，兩種方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及線性見表2。

2.3 ?精密度及加標(biāo)回收率

對濃度為10.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)生物胺混合溶液，采用國標(biāo)法及本研究方法所得衍生物，連續(xù)6次進(jìn)樣，各組分的峰面積及標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。同一個樣品制樣均勻后，用10.0、15.0 mg/L兩個濃度的混合生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收，兩種方法加標(biāo)回收率見表4。從表3、表4可以看出，所測各項(xiàng)生物胺的精密度指標(biāo)RSD均在5%以內(nèi)，加標(biāo)回收率在90%～110%之間，說明與國標(biāo)方法相比，該方法也是可靠的。

2.4 ?樣品檢測

本研究方法對市售15種魚、魚干及魚制品中生物胺的種類及其含量進(jìn)行檢測結(jié)果見表5。由表5可知，新鮮魚類各種生物胺含量較低，主要測出組分為組胺、腐胺、酪胺、尸胺，其他生物胺組分含量較低或未檢出。經(jīng)過急速真空干燥加工處理的魚干制品，如清江風(fēng)味魚各種成品等魚類制品生物胺含量也較低，市售散裝魚干組胺、腐胺、尸胺等含量較高。

3 ?結(jié)論

本研究采用新的衍生方法，改進(jìn)了樣品前處理，同時(shí)測定水產(chǎn)品中8種生物胺。該方法穩(wěn)定、操作簡單、準(zhǔn)確快速，對有效控制水產(chǎn)品質(zhì)量大有幫助。目前，消費(fèi)者及監(jiān)督機(jī)構(gòu)對漁產(chǎn)品及其制品控制項(xiàng)目多聚焦在獸藥殘留、抗生素殘留及防腐劑上，偶爾監(jiān)管部門會對組胺進(jìn)行檢測。從本研究檢測結(jié)果可知，對水產(chǎn)品的新鮮程度也應(yīng)加強(qiáng)控制和安全監(jiān)督，對其他生物胺組分也應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測。

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