王慧煜，鄭家昊，梅 琳，孔玉方，林祥梅，楊 素，韓雪清

（1.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；2.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617；3.拱北海關(guān)技術(shù)中心，廣東珠海 519020）

流感病毒屬于正黏病毒科（Orthomyxoviridae），為單股、負鏈、分節(jié)段RNA 病毒。根據(jù)核蛋白（nucleocapside protein，NP）和基質(zhì)蛋白（matrix protein，M）的不同，流感病毒可以分為A、B、C、D 4 個型別[1]。其中A 型流感病毒對人類威脅最大，不僅可以通過抗原轉(zhuǎn)移（antigenic drift）造成每年的季節(jié)性流行，而且會通過抗原轉(zhuǎn)變（antigenic shift）造成大流行。根據(jù)A 型流感病毒表面抗原血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）蛋白結(jié)構(gòu)及其基因特性的不同，A 型流感病毒又可分為許多血清型，目前已發(fā)現(xiàn)的HA 有18 個（H1—H18），NA 有11個（N1—N11）[2-3]。除可感染人外，A 型流感病毒還能感染多種動物宿主，包括野鳥、水禽、雞、狗、馬和豬等[4-6]，而且不同來源的HA 和NA 編碼基因能重配組合成上百種不同亞型的病毒，并可在不同宿主間傳播[7]。流感是傳播性極強的傳染病和人獸共患病，是世界衛(wèi)生組織（WHO）、世界動物衛(wèi)生組織（OIE）等聯(lián)合倡導全球共同防控的重大疫病。

由于A 型流感病毒亞型眾多，常規(guī)檢測方法，如多重RT-PCR 等無法檢測已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和可能發(fā)生變異的所有亞型。為解決這一棘手問題，本研究室成功研制出針對A 型流感病毒各亞型的基因芯片分型檢測方法[7-8]，能在同一張芯片上準確鑒定A 型流感病毒的H1—H16 和N1—N9 亞型。為驗證該方法在實際中的應(yīng)用效果，以及初步了解流感病毒各亞型在我國不同地區(qū)和不同宿主中的分布情況，對20 個地區(qū)、不同宿主源（雞、鴨、鵪鶉、鴿子、豬、人等）的16 852 份拭子和組織樣品進行了檢測，以期為流感的有效監(jiān)控和應(yīng)對新疫情暴發(fā)提供可靠的技術(shù)手段。

1 材料

1.1 樣品

收集自全國20 個?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）的16 852 份樣品，包括雞、鴨、鵪鶉、豬、人等的棉拭子及組織疑似樣本。

1.2 主要試劑和耗材

QIAGEN OneStep RT-PCR Kit、QIAamp?Viral RNA mini Kit（52904）、RNeasy? Mini Kit（74104），均購自QIAGEN 公司；2×SmartHyb雜交液，購自北京美萊博醫(yī)學科技有限公司；雜交圍欄，購自博奧（北京）生物技術(shù)有限公司。通用引物Uf：TCACTTGCTTCCGTTGAGG；通用引物Ur：TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGT。引物均由上海生工生物公司合成。

1.3 主要儀器

高速微量離心機（Sigma，USA）；水浴鍋（PolyScience，美國）；渦旋儀（江蘇海門市其林貝爾公司）；生物安全柜（NU，美國）；恒溫鼓風干燥箱（中國智成）；Eppendorf Mastercycler PCR 儀（Eppendorf AG，德國）；PerkinElmer ScanArray Gx plus（PE，美國）。

2 方法

2.1 核酸提取

拭子樣品和組織樣品分別按照QIAamp? Viral RNA mini Kit 和RNeasy? Mini Kit 操作說明進行樣品核酸提取，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 多重不對稱RT-PCR

反應(yīng)體系：Onestep RT-PCR buffer（5×）10.0 μL、dNTP（10 mmol/L）2.0 μL、Enzyme mix 2.0 μL、RNase inhibitor 0.5 μL、RNA 模 板5.0 μL、特異性上游引物（10 μmol/L）0.5 μL、特異性下游引物（10 μmol/L）1.0 μL、通用引物Uf（10 μmol/L）0.5 μL、通用引物Ur（10 μmol/L）10.0 μL，加ddH2O（RNase-free）至50 μL。

反應(yīng)條件：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；95 ℃15 min；94 ℃ 20 s，52 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，共20個循環(huán)；94 ℃ 20 s，70 ℃ 90 s，共20 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

2.3 雜交

取擴增產(chǎn)物5.2 μL、雜交質(zhì)控探針0.8 μL 和2×SmartHyb 雜交液6 μL 于0.2 mL PCR 管中，混勻；95 ℃變性5 min，立即冰浴3 min，4 000 r/min離心5～10 s，然后將離心管放回冰浴；在雜交盒的溝槽中加入200 μL 蒸餾水，以防止雜交體系蒸發(fā)，然后將芯片正面向上放入盒中；將已變性的雜交樣品從冰盒中取出，用槍頭輕輕吹吸3～5 次后，取7 μL 雜交混合液加到探針點陣區(qū)，迅速蓋上蓋片和雜交盒并密封；將雜交盒水平放入52 ℃的水浴鍋中，雜交2.5 h。

2.4 洗滌

雜交結(jié)束后，立即將芯片取出，放入預(yù)熱至45 ℃的洗滌液Ⅰ中，100 r/min 水平振蕩洗滌5 min，相同條件重復(fù)1 次；取出芯片，放入預(yù)熱至45 ℃的洗滌液Ⅱ中，100 r/min 水平振蕩洗滌5 min，相同條件重復(fù)1 次；取出芯片，放入洗液Ⅲ中，100 r/min 室溫振蕩5 min；將芯片在無水乙醇中浸提5 s，然后把芯片放入芯片盒中，1 000 r/min 離心5 min。

2.5 結(jié)果判定

用基因芯片掃描儀進行芯片掃描（波長532 nm、PMT 60%、激光能量90%，掃描儀參數(shù)不作硬性規(guī)定）。

在試驗結(jié)果成立的前提下，如果樣品RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)雜交后，在各自的位置上出現(xiàn)特異性熒光信號，則判定為A 型流感病毒各個亞型（包括HA和NA）核酸陽性。每條探針有2 個重復(fù)位點，出現(xiàn)2 個或2 個以上熒光信號者判為該亞型核酸陽性；出現(xiàn)1 個熒光信號需進行重復(fù)試驗再次讀判，如果仍出現(xiàn)1 個熒光信號，就判為可疑，可采用普通RT-PCR 方法加序列測定和熒光定量RT-PCR 方法等進一步驗證。如果只有HA 或者只有NA 位點出現(xiàn)熒光信號，或者2 個以上HA 或NA 亞型位點出現(xiàn)熒光信號，都判定為該亞型核酸陽性。

3 結(jié)果

應(yīng)用分型基因芯片技術(shù)，共檢測樣品16 852份，檢出陽性2 582 份，陽性檢出率為15.32%，共檢測到H1N1、H2N9、H3N2、H4N6、H5N1、H7N1、H7N9、H9N2、H10N5、H16N3 等10 個亞型，均與陽性樣品序列測定結(jié)果一致（表1）。在所有陽性樣品中，H5N1 亞型檢出率最高，為33.54%，其次是H7N1，檢出率為22.31%。各亞型陽性檢出情況見表2，不同地區(qū)陽性檢出情況見表3。

表1 不同宿主樣品檢測結(jié)果 單位：份

4 分析與討論

本研究采集了我國從東到西、從南到北20 個?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）部分地區(qū)養(yǎng)殖場、活禽市場和出入境口岸的不同動物樣品以及人類樣品，利用研制的A 型流感病毒分型基因芯片進行篩查，對檢出的陽性樣品，同時進行測序鑒定，發(fā)現(xiàn)芯片檢測結(jié)果與測序結(jié)果一致，進一步證明了所建立方法的可靠性。該檢測方法在一張基因芯片上集成了A型流感病毒H1—H16 和N1—N9 的52 條特異性探針，針對每個亞型有2～4 條探針，而且每條探針又有2 個重復(fù)位點，因此可迅速、準確定型分析流感病毒的不同亞型，也能檢測到變異重組的流感病毒株。總之，該基因芯片檢測方法不僅有助于A 型流感疫情的有效監(jiān)控，也可在第一時間內(nèi)準確發(fā)現(xiàn)流感病毒基因重排的流行亞型，從而為及時應(yīng)對新疫情暴發(fā)提供了可靠的技術(shù)儲備。

表2 各亞型陽性樣品檢出結(jié)果統(tǒng)計

A 型流感在不同宿主間跨種傳播時，會產(chǎn)生新重配病毒，而導致歷次流感大流行的病毒都是來自不同宿主的流感病毒重配后產(chǎn)生的新病毒。1957年亞洲流感大流行和1968 年我國香港流感大流行的病原均為當時人群中流行的流感病毒與禽流感病毒重配后產(chǎn)生的新病原；2009 年的A 型H1N1 流感病毒也是人-豬-禽流感病毒的重配病毒。由于A 型流感病毒宿主范圍廣，因此從流感病毒的自然生態(tài)分布來看，流感大流行的發(fā)生是難以避免的。目前能做到的就是加強監(jiān)測，及早發(fā)現(xiàn)可能導致流感大流行的新型病毒，從而將流感大流行的危害降到最低[9]。

表3 不同地區(qū)樣品檢測數(shù)量及檢出亞型分布

2013 年以前，國際上已報道了人感染H5N1、H7N7、H7N3、H7N2、H9N2、H10N7 等亞型禽流感的病例；2013 年春季起，我國出現(xiàn)人H7N9 流感病例[10]，同年12 月在江西省南昌市確診了全球首例人H10N8 禽流感病例[11]。最近幾年，高致病性禽流感在全球廣泛發(fā)生，其中H5N1、H5N3、H5N6 和H5N8 等亞型在我國均有流行，而H5N1亞型還見于亞洲其他國家和非洲，H5N2 亞型還見于北美洲，H5N6 亞型還見于東南亞國家等。H5N8 亞型獨立流行于東亞、西歐和北美3 個地區(qū)[12]。低致病性禽流感呈全球散發(fā)狀態(tài)，除H5 和H7 亞型外，個別地區(qū)出現(xiàn)其他亞型，如H9N2、H10N8、H10N7、H11N2 等[13-14]。本研究檢測到了一些不常見亞型的流感病毒，如H10、H16 等。

針對上述不常見亞型病毒的分離工作，將是后續(xù)工作的重點，尤其需要加強活禽市場的流感病毒監(jiān)測。既往研究[15]提示，活禽市場在禽流感病毒的保存、繁殖和傳播中起著至關(guān)重要的作用，是禽流感病毒基因混合池，為不同亞型禽流感病毒基因重組提供了有利條件，是人感染禽流感病毒的主要源頭，也是預(yù)防和控制禽流感的關(guān)鍵所在。