劉樞清，孫秀峰，何宇乾

（1.青島市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山東青島 266199；2.青島市畜牧獸醫(yī)研究所，山東青島 266121）

A 型塞內(nèi)卡病毒（Senecavirus A，SVA），舊稱塞內(nèi)卡谷病毒（Seneca Valley virus，SVV），屬于小RNA 病毒科（Picornaviridae）塞內(nèi)卡病毒屬（Senecavirus）成員。該病毒于2002 年在美國(guó)馬里蘭州的“塞尼卡河州立公園（Seneca Creek State Park）”附近的實(shí)驗(yàn)室首次被發(fā)現(xiàn)，具有偶然性，最初是從被胎牛血清或豬胰蛋白酶污染的PER.C6細(xì)胞系中分離到[1]，而來(lái)自豬胰蛋白酶污染來(lái)源的可能性更大，因?yàn)榇罅颗cSVA 血清學(xué)相關(guān)的病毒都分離自豬。

SVA 自2007 年逐漸在加拿大、美國(guó)、巴西等國(guó)家暴發(fā)。2015 年我國(guó)廣東省首次發(fā)現(xiàn)該病毒，隨后逐漸蔓延至其他省份。豬感染SVA 后的臨床表現(xiàn)與感染口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）類似，通常表現(xiàn)為沉郁、體溫升高、厭食、跛行、蹄部和鼻吻出現(xiàn)水皰[2]。水皰是該病的典型癥狀，蹄部水皰常見(jiàn)于蹄冠帶和趾間隙[3]。SVA 感染的診斷目前主要依賴于病原學(xué)和血清學(xué)方法，防控方面仍無(wú)商品化疫苗可用。另外，隨著SVA 在我國(guó)的傳播，其毒力也逐漸致弱，目前國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)已頻繁出現(xiàn)亞臨床感染情況[4]。大量的亞臨床感染及無(wú)商品疫苗可用，增加了我國(guó)對(duì)該病的防控及凈化難度。

1 分子生物學(xué)

1.1 SVA 粒子結(jié)構(gòu)

SVA 結(jié)構(gòu)（圖1）與FMDV 類似，為非囊膜正二十面體結(jié)構(gòu)，T 值為3，直徑約27 nm，內(nèi)部為病毒核酸。病毒含4 種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為VP1、VP2、VP3 和VP4，其中VP1、VP2 和VP3 構(gòu)成了病毒衣殼的外層結(jié)構(gòu)，VP4 在衣殼內(nèi)部。

圖1 A 型塞內(nèi)卡病毒結(jié)構(gòu)

1.2 SVA 基因組

SVA 基因組（圖2）為單股、線性、正義RNA，長(zhǎng)度約為7 300 nt?；蚪M5'末端結(jié)合VPg，為非帽子結(jié)構(gòu)，靠近5'末端為IV 型內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry site，IRES），為蛋白翻譯的上游非編碼區(qū)域，約666 nt?；蚪M3'末端為poly（A）結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度約為70 nt[5]。SVA 基因組僅含有一個(gè)較長(zhǎng)的開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF），編碼一個(gè)約2 180 aa 的多肽，而后經(jīng)過(guò)進(jìn)一步加工，形成不同的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。

各蛋白在基因組中呈“L-4-3-4”樣排列（圖2），即“Leader-4 個(gè)P1 區(qū)多肽-3 個(gè)P2 區(qū)多肽-4個(gè)P3 區(qū)多肽”。P1 區(qū)對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)蛋白VP0、VP3和VP1，VP0 又進(jìn)一步加工形成VP2 和VP4。P2和P3 區(qū)對(duì)應(yīng)非結(jié)構(gòu)蛋白，主要參與蛋白加工和病毒復(fù)制。所有非結(jié)構(gòu)蛋白中，2A 蛋白的形成機(jī)制較為特殊，其總長(zhǎng)為9 aa，羧基末端為保守基序NPG/P，因此可通過(guò)核糖體跳躍機(jī)制使蛋白翻譯“中止”但不“終止”[5]。

圖2 A 型塞內(nèi)卡病毒基因組結(jié)構(gòu)及多聚蛋白水解圖

2 臨床癥狀

2.1 自然感染

高毒力SVA 自然感染豬后會(huì)導(dǎo)致典型的水皰型臨床癥狀，與豬的某些其他疫病癥狀類似，如口蹄疫、豬水泡病及水泡性口炎等。動(dòng)物感染SVA 后，在鼻吻處會(huì)出現(xiàn)水皰性病變，通常為大小不一、充滿液體的水皰（圖3-A），破裂后可形成潰瘍面（圖3-B），多日后形成結(jié)痂。水皰性及潰瘍性病變多出現(xiàn)于蹄冠帶和趾間隙，導(dǎo)致邊緣上皮疏松壞死，嚴(yán)重者站立及行走困難[6]?；疾?dòng)物同時(shí)伴有厭食、精神沉郁、體溫升高等現(xiàn)象。某些患病仔豬3～10 d后，癥狀可消退并臨床康復(fù)[7]。

圖3 豬感染SVA 的臨床癥狀[8]

2.2 人工感染

國(guó)外學(xué)者通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)深入研究了SVA 的致病機(jī)制[2-3]。通過(guò)口鼻途徑進(jìn)行SVA 感染動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，4 d 后便可觀察到典型的臨床癥狀。病毒血癥持續(xù)期較短，通常維持在感染后的3～10 d。感染后1～28 d，便可在口鼻及糞便中檢測(cè)病毒[2]。若為急性感染，1～5 d 后口腔中的病毒分泌量便可達(dá)到峰值[2]。2019 年Buckley 等[9]對(duì)15 只8 月齡母豬進(jìn)行了SVA 鼻內(nèi)感染試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)感染2 d 后，4 只母豬的蹄冠帶便出現(xiàn)水皰樣病變，其他母豬在感染5 d 內(nèi)在該部位皆出現(xiàn)類似病變；6 只母豬感染4 d后，口吻部出現(xiàn)水皰樣病變。病毒血癥持續(xù)1 周，感染后7 d，出現(xiàn)血清中和抗體。大部分水皰樣病變感染2 周后便自行消退。

國(guó)內(nèi)分離株（GD-S5/2018 和GD04/2017）的小鼠感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過(guò)肌肉、皮下及口服途徑感染，GD-S5/2018 株可導(dǎo)致較高的致死率，但GD04/2017 株卻未導(dǎo)致明顯的臨床癥狀。豬感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GD-S5/2018 株可導(dǎo)致典型的臨床癥狀，如齒齦和舌部出現(xiàn)潰瘍性病變，但GD04/2017株攻毒后，豬僅表現(xiàn)沉郁，未有SVA 感染的典型臨床癥狀。這說(shuō)明GD-S5/2018 是強(qiáng)毒株，而GD04/2017 的毒性較弱[10]。2020 年Zhang 等[11]比較了另外2 個(gè)國(guó)內(nèi)分離株（HB-CH-2016 和CH/AH-02/2017）的毒力，發(fā)現(xiàn)CH/AH-02/2017 株可導(dǎo)致明顯的臨床癥狀，而HB-CH-2016 株的致病性相對(duì)較弱。

3 流行病學(xué)

3.1 國(guó)際SVA 感染情況

SVA 是一種新發(fā)病原體。2007 年加拿大首次報(bào)道了SVA 感染病例[12]。2012 年美國(guó)報(bào)道了豬群中有SVA 流行，但追溯發(fā)現(xiàn)2010 年已有豬群發(fā)病[13]。2014 年前，除北美地區(qū)外，SVA 未在其他地區(qū)報(bào)道，直到2014 年末，巴西報(bào)道了首例SVA感染病例[14]，而與美國(guó)和加拿大不同的是，巴西的SVA 感染不僅局限于成年豬，新生仔豬亦有感染[7，15]。隨后其他國(guó)家皆發(fā)現(xiàn)了SVA 感染的病例，包括中國(guó)（2015）[16]、哥倫比亞（2016）[17]、泰國(guó)（2016）[18]和越南（2018）[19]等。

2015—2016 年是全球局部地區(qū)的SVA 感染高發(fā)期。對(duì)此期間的SVA 分離株基因組序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)各毒株間的基因同源性較高（95.8%～99.9%），而與歷史株SVV-001 的同源性較低（93.8%～94.6%）?；赟VAVP1基因部分序列（541 bp）進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，可將病毒分為3 個(gè)以時(shí)間為參考的基因系（Clade），分別為Clade I、Clade II 和Clade III[8]。Clade I 為SVA 原型毒株，如88-23626 株（Genbank：EU271759）；Clade II 為歷史毒株，如SVV-001 株（Genbank：DQ641257）；Clade III 為當(dāng)前毒株，如CHLX-01-2016（Genbank：KX751945）。Clade III 基因系毒株最多，包括美國(guó)、加拿大、巴西、中國(guó)和泰國(guó)的分離株。

3.2 國(guó)內(nèi)SVA 感染情況

2015 年，SVA 首次傳入我國(guó)廣東省2 個(gè)豬場(chǎng)，導(dǎo)致豬群出現(xiàn)水皰型病變及新生仔豬死亡。在排除口蹄疫、豬水皰性口炎等疑似疫病后，最終確診為SVA 感染[16]。2016 年，湖北省某豬場(chǎng)出現(xiàn)SVA 感染病例[20]，其分離毒株（HB-CH-2016 株）與廣東省首個(gè)分離毒株（CH-01-2015）核酸同源性極高，說(shuō)明兩次疫情具有密切的流行病學(xué)相關(guān)性。2016年12 月，黑龍江省某豬場(chǎng)的育肥豬經(jīng)檢測(cè)感染SVA，其分離株與美國(guó)毒株同源性高于其他中國(guó)毒株，說(shuō)明此次黑龍江分離株可能源自美國(guó)。2017 年，河南省和福建省幾乎同時(shí)報(bào)道了SVA 感染[6]，分離自這兩個(gè)省份的3 個(gè)毒株間具有極高的核酸同源性，說(shuō)明三者可能源自同一毒株。

近些年，SVA 在我國(guó)某些省份再次出現(xiàn)，尤其廣東省時(shí)常有SVA 感染的報(bào)道[21-24]，且分離株已呈現(xiàn)出不同的進(jìn)化分支。張志等[25]將2016—2018 年15 個(gè)省份的數(shù)百份臨床病料進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)大部分省份皆檢測(cè)到陽(yáng)性。結(jié)合已有報(bào)道，目前SVA 感染的省、自治區(qū)和直轄市包括廣東、廣西、云南、貴州、湖南、福建、四川、湖北、河南、山東、新疆、上海、遼寧和黑龍江等14 個(gè)，表明SVA 已在我國(guó)不同地域廣泛流行。2019 年代蕾等[26]報(bào)道了海南省同樣存在SVA 感染，應(yīng)用間接 ELISA 方法，對(duì)海南省2 547 份豬血清樣品進(jìn)行SVA 抗體檢測(cè)，結(jié)果抗體陽(yáng)性率為10.9%。

SVA 自2015 年傳入我國(guó)后，已進(jìn)化出5 個(gè)遺傳分支。遺傳進(jìn)化分析表明，大部分分離株與美國(guó)毒株的同源性較高[24]。SVA 在我國(guó)正以較快的速度進(jìn)化，同時(shí)不斷有報(bào)道稱，毒株間已發(fā)生重組并形成新的重組病毒[27-29]。病毒間的重組，使SVA在我國(guó)的遺傳多樣性更加復(fù)雜，因而也增加了潛在的跨物種傳播風(fēng)險(xiǎn)。

4 診斷方法

4.1 病原學(xué)診斷

因SVA 為RNA 病毒，所以目前建立的病原學(xué)檢測(cè)方法為基于RNA 的檢測(cè)。針對(duì)的檢測(cè)區(qū)域主要為基因組的3D、5'端UTR 或VP1 內(nèi)部的保守片段，建立的方法為常規(guī)RT-PCR[30-31]、定量RT-PCR[32-34]、數(shù)字RT-PCR[35-36]及RT-LAMP[37-38]等，另有SVA 和FMDV雙重RT-PCR檢測(cè)方法的報(bào)道[39]。病原學(xué)檢測(cè)，尤其定量RT-PCR，其敏感性可達(dá)10 拷貝/μL，且與口蹄疫、水泡性口炎等類似疫病無(wú)交叉反應(yīng)，因此是常見(jiàn)的臨床核酸檢測(cè)方法。數(shù)字PCR 技術(shù)是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)，已應(yīng)用至SVA 感染的病原學(xué)檢測(cè)。相較于熒光定量PCR，數(shù)字PCR能夠直接對(duì)核酸分子拷貝數(shù)進(jìn)行絕對(duì)定量。然而，病原學(xué)檢測(cè)的缺點(diǎn)顯而易見(jiàn)，即病毒在不同組織的載量（或排毒量）隨時(shí)間變化的差異性會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)差異。因此，為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)盡量采集不同組織的樣品用于檢測(cè)，如血清、淋巴結(jié)、糞便、唾液及水皰液等[8]。

4.2 血清學(xué)診斷

SVA 血清學(xué)診斷主要是基于血清抗體的檢測(cè)，目前已建立的方法包括間接ELISA[40]、競(jìng)爭(zhēng)ELISA[41-42]及病毒中和試驗(yàn)[41]等。競(jìng)爭(zhēng)ELISA 是目前應(yīng)用最為廣泛的血清學(xué)檢測(cè)方法，也有商品化檢測(cè)試劑盒在售。該方法的敏感性和特異性較為理想，推薦臨床檢測(cè)使用。病毒中和試驗(yàn)的敏感性和特異性皆高于競(jìng)爭(zhēng)ELISA[41]，但操作過(guò)程復(fù)雜，且需數(shù)日才可判定結(jié)果，因此不適用于SVA 感染的快速診斷。

5 疫苗研發(fā)

SVA 在豬群中流行已有十余年，但仍無(wú)商品化疫苗，豬場(chǎng)只能采用生物安全措施對(duì)其進(jìn)行防控，因此開(kāi)發(fā)高效疫苗至關(guān)重要。

5.1 活疫苗

SVA 在體內(nèi)能誘導(dǎo)體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)[43]。2019 年Sharma 等[44]通過(guò)反向遺傳技術(shù)拯救了一株重組SVA，并在豬體內(nèi)評(píng)估了重組病毒的免疫原性及免疫保護(hù)性。結(jié)果顯示，重組病毒是一株弱毒株，動(dòng)物經(jīng)接種后未出現(xiàn)明顯臨床癥狀，病毒血癥及排毒現(xiàn)象都相對(duì)較弱。雖然毒力致弱，但重組病毒依然維持著較理想的免疫原性。4 周齡仔豬經(jīng)單次肌內(nèi)注射及滴鼻免疫后，可在免疫后3～7 d 內(nèi)產(chǎn)生較高滴度的中和抗體。除了誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，重組活病毒還可誘導(dǎo)記憶性T 細(xì)胞（CD4+、CD8+及CD4+/CD8+T 細(xì)胞）的增殖反應(yīng)。而且，仔豬經(jīng)免疫后可以耐受異源SVA 的人工感染，攻毒后并未表現(xiàn)出明顯臨床癥狀，且病毒血癥、排毒量及組織病毒載量都有所降低，說(shuō)明該重組SVA 是一株有效的活疫苗候選株。

5.2 滅活苗

雖然活疫苗可以誘導(dǎo)理想的體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)，但具有潛在的生物安全風(fēng)險(xiǎn)，如毒力反強(qiáng)。而滅活苗不具有潛在的生物安全風(fēng)險(xiǎn)，因此是另一種理想的候選疫苗。2018 年Yang 等[45]通過(guò)二乙烯亞胺將SVA 滅活后，與油佐劑混合乳化制備了滅活疫苗。動(dòng)物免疫試驗(yàn)顯示，該滅活苗可誘導(dǎo)理想的中和抗體反應(yīng)，且攻毒后動(dòng)物未表現(xiàn)出明顯臨床癥狀，說(shuō)明該油佐劑滅活苗是有效的SVA 候選疫苗。

6 結(jié)語(yǔ)

SVA 是近些年在多個(gè)國(guó)家出現(xiàn)的一種跨境傳播病毒，可導(dǎo)致典型的水皰型臨床癥狀，已對(duì)多國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了不同程度的影響。SVA 感染目前在國(guó)內(nèi)未像非洲豬瘟那樣給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)毀滅性的影響，但不應(yīng)忽視的是SVA 屬于RNA 病毒，可能具有較強(qiáng)的變異性，因此該病毒未來(lái)的流行態(tài)勢(shì)如何演變，目前很難預(yù)測(cè)。而且，目前仍無(wú)商品化疫苗可用，且國(guó)內(nèi)診斷試劑研發(fā)相對(duì)滯后，這都不利于該病毒的防控。因此，相關(guān)工作者應(yīng)當(dāng)密切關(guān)注SVA 在全球的流行現(xiàn)狀，并深入研究SVA 的致病及免疫機(jī)理，同時(shí)研發(fā)有效的疫苗和診斷試劑。