（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）屬于皰疹病毒科，會(huì)導(dǎo)致成年母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎以及仔豬中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，未免疫母豬產(chǎn)下的仔豬感染PRV 時(shí)，死亡率可達(dá)100%[1-2]。早在1947 年，我國(guó)首次從患貓?bào)w內(nèi)檢測(cè)出PRV。1970 年后，PRV 在我國(guó)呈蔓延趨勢(shì)，直至從匈牙利引入Bartha-K61 株疫苗后，疫情才得到有效控制[3]。2011 年以來(lái)，PRV 在我國(guó)發(fā)生變異，使Bartha-K61 疫苗不能提供足夠的保護(hù)，導(dǎo)致偽狂犬病迅速流行，并席卷全國(guó)[4-7]，其中母豬患病率達(dá)35%以上，野毒感染豬群超過(guò)50%，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失[8]。PRV 基因組編碼許多蛋白，其中g(shù)E 蛋白是主要的毒力因子。在PRV 變異株感染的豬群中，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)gE基因抗體水平逐年上升。因此，gE基因缺失疫苗可以在降低病毒毒力的同時(shí)區(qū)分野毒感染和疫苗免疫[9]。我國(guó)最初引入的Bartha-K61 株就是gE基因缺失疫苗株。早在2000年，何啟蓋等[10]使用TK-/gG-/LacZ+突變株進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，證實(shí)PRV 基因缺失毒株的安全范圍比親本毒株廣，具有很好的免疫原性。自2013 年以來(lái)，CRISPR/Cas9 技術(shù)作為強(qiáng)大的基因編輯技術(shù)[11]，已經(jīng)在病毒基因編輯上獲得了廣泛應(yīng)用，如：Van等[12]利用CRISPR/Cas9 技術(shù)成功編輯了HCMV和HSV-1；2018 年穆艷霞等[13]使用CRISPR/Cas9技術(shù)，利用先重組EGFP 標(biāo)簽反向篩選的方法成功獲取了IBR-ΔgE病毒；湯艷東等[14]構(gòu)建了螢光素酶標(biāo)記基因、EGFP 基因雙標(biāo)簽重組病毒，同時(shí)建立了PRV 大片段缺失平臺(tái)，證實(shí)了2 個(gè)sgRNA介導(dǎo)的大片段基因缺失效率更高。因此，本研究基于CRISPR/Cas9 技術(shù)與實(shí)驗(yàn)室分離到的PRV 毒株，快速對(duì)其gE基因進(jìn)行編輯，旨在為今后的PRV 基因編輯提供思路，也為后期應(yīng)對(duì)PRV 變異株的基礎(chǔ)研究及防控提供一種候選方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與細(xì)胞系 PRV-1 毒株，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院傳染病教研室分離、鑒定及保存；PK-15（豬腎細(xì)胞）、VERO（非洲綠猴腎細(xì)胞），由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病教研室保存。

1.1.2 主要試劑及載體 胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），DMEM 培養(yǎng)基，opti-MEM 以及EDTA-胰酶，購(gòu)自Gibco 公司；BbsI 限制性核酸內(nèi)切酶，購(gòu)自NEB 公司；PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 高保真酶、solution I，購(gòu)自TaKaRa 公司；DNA 提取試劑盒、膠回收試劑盒，購(gòu)自Therom公司；病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒，購(gòu)自TIANGEN 公司；低熔點(diǎn)瓊脂糖，購(gòu)自Sigma 公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofactamine 3 000，購(gòu)自Thermo Fisher公司；大腸桿菌DH5ɑ 感受態(tài)細(xì)胞、Stbl 3 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pcDNA3.1載體、pSpCas9-2A-puro 和pSpCas9（BB）-2A-GFP 載體，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病教研室保存。

1.2 方法

1.2.1 PRVgE基因克隆測(cè)序 根據(jù)NCBI 上已公布的偽狂犬病毒（PRV）基因序列（登錄號(hào)KU056477.1），在primer premier 5.0 軟件上設(shè)計(jì)針對(duì)gE基因的上下游引物PRV-gE-F、PRV-gE-R（表1）；以本實(shí)驗(yàn)室提取的PRV-1 基因組為模板，采用PCR 方法擴(kuò)增gE基因。PCR 反應(yīng)體系：ddH2O 15 μL、GXL buffer 5 μL、dNTP 2 μL 以及PRV-gE-F、PRV-gE-R 各1 μL，PRV-1 基因組0.75 μL，GXL DNA Polymerase 酶0.25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性120 s；98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，68 ℃延伸120 s，35 個(gè)循環(huán)；68 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物送華大基因有限公司測(cè)序。

1.2.2 野生病毒感染力測(cè)定 將PRV-1 病毒按照10-1～10-8進(jìn)行10 倍倍比稀釋后，各吸取100 μL 病毒稀釋液，接種于長(zhǎng)到80%左右的PK-15 細(xì)胞上，每組8 個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。逐日觀察并記錄結(jié)果，5 d 后按照Reed-Muench 法進(jìn)行TCID50測(cè)定。計(jì)算公式為：

表1 試驗(yàn)所用引物及目的

將比距加在高于50%死亡稀釋度的對(duì)數(shù)上，即為0.1 mL 所含病毒液的稀釋度。

1.2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞系篩選 首先將pSpCas9（BB）-2A-GFP 載體，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法（Lipofectamine?3 000），將PX459-1、PX459-2 和PX459-3 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染PK-15 細(xì)胞與VERO 細(xì)胞，48 h 后熒光顯微鏡（ZEISS、HAL100）下觀察，篩選轉(zhuǎn)染效率較高的細(xì)胞系。

1.2.4 CRISPR/Cas9 載體構(gòu)建及篩選 按照1.2.1測(cè)序得到PRVgE基因序列，通過(guò)網(wǎng)站http://crispr.mit.edu/設(shè)計(jì)3 對(duì)分?jǐn)?shù)較高且GC 含量約50%的gE-sgRNA，并合成其互補(bǔ)引物對(duì)（表1）；將互補(bǔ)的gE-sgRNA 引物gE-sgRNA1-F/gE-sgRNA1-R、gE-sgRNA2-F/gE-sgRNA2-R 和gE-sgRNA3-F/gEsgRNA3-R 進(jìn)行95 ℃ 5 min 高溫變性，然后逐漸降溫至16 ℃，獲得3 條雙鏈sgRNA；以BbsI 雙酶切pSpCas9-2A-puro 載體，膠回收大的載體片段；將3 條雙鏈gE-sgRNA 連入pSpCas9-2A-puro 酶切回收的載體中，使用Solution I 16 ℃過(guò)夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Stbl 3 感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，對(duì)測(cè)序結(jié)果使用snapgene 軟件分析，獲得CRISPR/Cas9 重組質(zhì)粒PX459-1、PX459-2 和PX459-3。將構(gòu)建好的PX459-1、PX459-2 和PX459-3 分別轉(zhuǎn)染VERO 細(xì)胞，12 h 后接種MOI=0.1 的PRV-1，感染48 h 后使用10%中性甲醛固定2 h，之后使用0.8%結(jié)晶紫染色0.5 h，沖洗干凈后觀察。

1.2.5 PRV-1-ΔgE構(gòu)建 利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將CRISPR/Cas9 載體PX459-1、PX459-2，按 照1:1 的比例轉(zhuǎn)染入VERO 細(xì)胞培養(yǎng)6 h，更換含2%FBS 的細(xì)胞維持液，培養(yǎng)至12 h 后接種MOI=0.1的PRV-1，待細(xì)胞病變至90%左右時(shí)收毒；將病毒反復(fù)凍融3 次，按照1:1 000 稀釋度稀釋感染6 孔板中的PK-15 細(xì)胞，病毒吸附2 h 后，使用DMEM（含2% FBS、1%低熔點(diǎn)瓊脂糖）覆蓋，置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；于超凈工作臺(tái)中使用槍頭隨機(jī)挑起10 個(gè)病毒蝕斑，分別置于200 μL DMEM 中，反復(fù)凍融3 次后接種生長(zhǎng)至90%的PK-15 細(xì)胞。重復(fù)以上步驟，噬斑克隆純化5 代，然后將病毒接種于PK-15 細(xì)胞中擴(kuò)大培養(yǎng)，提取病毒基因組，使用檢測(cè)引物seq-PRVgE-F/R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增檢測(cè)。PCR 體系與反應(yīng)條件與1.2.1 中介紹相同。將測(cè)序結(jié)果使用MEGA 7 軟件進(jìn)行對(duì)比分析，鑒定后擴(kuò)大培養(yǎng)，-80 ℃保存。

1.2.6 PRV-1-ΔgE遺傳穩(wěn)定性檢測(cè) 將PRV-1-ΔgE接種至PK-15 細(xì)胞，連續(xù)傳代至第20 代，并取第5、10、20 代缺失病毒DNA，使用PRV-gE-F和PRV-gE-R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物送華大基因測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRV-1 gE 基因PCR 擴(kuò)增

按照1.2.1 中PCR 體系獲得的gE基因測(cè)序結(jié)果為1 740 bp，與試驗(yàn)預(yù)期一致（圖1）。

圖1 PRV gE 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.2 PRV 野毒感染力測(cè)定

野生病毒感染力測(cè)定如表2 所示。當(dāng)病毒稀釋至10-6時(shí)，出現(xiàn)CPE 的細(xì)胞孔所占百分比高于50%，為76.9%，稀釋至10-7時(shí)，出現(xiàn)CPE 的細(xì)胞孔所占百分比低于50%，為36.4%。

將表2 所測(cè)得數(shù)據(jù)帶入1.2.2 中的公式，得到的比距約為0.7，加上高于50%感染的稀釋度對(duì)數(shù)（10-6），PRV-1 的TCID50為10-7.7/mL。

2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞系篩選

通過(guò)熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)VERO 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高于PK-15 細(xì)胞（圖2），因此本試驗(yàn)選擇VERO 細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。

2.4 CRISPR/Cas9 質(zhì)粒構(gòu)建與篩選

根據(jù)snapgene 軟件分析結(jié)果，判定CRISPR/Cas9 質(zhì)粒PX459-1、X459-2 和PX459-3 構(gòu)建成功（圖3）。將PX459-1、X459-2 和PX459-3 質(zhì) 粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選，發(fā)現(xiàn)sgRNA1 和sgRNA2 效率大于sgRNA3（圖4），因此選擇sgRNA1 和sgRNA2做后續(xù)試驗(yàn)。

表2 病毒TCID50 測(cè)定結(jié)果

圖2 pSpCas9（BB）-2A-GFP 在PK-15 與VERO 細(xì)胞上的轉(zhuǎn)染效率（50×）

2.5 PRV-1-ΔgE 構(gòu)建

圖3 sgRNA 構(gòu)建測(cè)序結(jié)果

圖4 sgRNA 篩選結(jié)果

使用seq-PRV-gE-F/R 引物進(jìn)行PCR 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)gE基因發(fā)生缺失（圖5）；將測(cè)序結(jié)果使用MEGA 7 軟件比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，PCR 產(chǎn)物大小為2 424 bp，與預(yù)期一致，PRV-1-ΔgE為2 132 bp，gE基因323～613 bp 位置缺失291 bp（圖6）。

圖5 PRV gE 基因檢測(cè)引物PCR 鑒定結(jié)果

圖6 PRV-1 與PRV-1-ΔgE 測(cè)序比對(duì)結(jié)果

2.6 PRV-1-ΔgE 遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)

將PRV-1-ΔgE連續(xù)傳代至20 代，分別取5、10、20 代病毒進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有發(fā)生堿基突變現(xiàn)象。

3 討論

目前，針對(duì)PRV 感染還沒(méi)有系統(tǒng)有效的治療方法，因此疫苗接種是控制其流行和凈化的有效方法。自2011 年以來(lái)，PRV 不斷發(fā)生變異，至今依然在我國(guó)部分地區(qū)廣泛流行[15-16]，因此快速應(yīng)對(duì)新發(fā)變異的PRV 就顯得尤為重要。這些基因的缺失會(huì)導(dǎo)致PRV 毒力降低，且不影響病毒的感染和復(fù)制能力。據(jù)相關(guān)資料[17-18]顯示，一些歐美國(guó)家通過(guò)基因缺失疫苗免疫，已經(jīng)根除了PRV。PRV 基因工程疫苗研制通常選用缺失TK、gE、gI或gG等毒力基因[19-20]。

穆艷霞等[13]使用CRISPR/Cas9 技術(shù)編輯IBRV，在gE基因位置處重組EGFP 熒光標(biāo)記，通過(guò)sgRNA 反向敲除EGFP 基因構(gòu)建IBR-ΔgE病毒。吳鳳筍[21]使用傳統(tǒng)的同源重組結(jié)合Cre/loxp系統(tǒng)，先在gE、TK位置分別重組EGFP 標(biāo)記基因，篩選攜帶熒光的PRV，后將標(biāo)記基因分別切除構(gòu)建了1 株P(guān)RV-ΔgE-ΔTK重組病毒。靶向基因編輯技術(shù)與傳統(tǒng)的同源重組技術(shù)相比較，它對(duì)基因組的修飾效率可以提高103～105倍[22]。因此，本研究基于CRISPR/Cas9 技術(shù)，僅通過(guò)單獨(dú)轉(zhuǎn)染1 對(duì)sgRNA，接種病毒誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)非同源末端修復(fù)即獲得PRV-1-ΔgE。相比較于傳統(tǒng)的同源重組技術(shù)，CRISPR/Cas9 技術(shù)大大提高了基因編輯篩選速度與效率。首先，在CRISPR/Cas9 技術(shù)當(dāng)中，篩選轉(zhuǎn)染效率高的細(xì)胞系與獲得高效的sgRNA至關(guān)重要。因此，本試驗(yàn)首先選擇了PK-15 細(xì)胞與VREO 細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，經(jīng)過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)VERO 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率遠(yuǎn)高于PK-15 細(xì)胞且可以被PRV 感染。本試驗(yàn)結(jié)果與湯艷東[13]、穆艷霞[14]等細(xì)胞系篩選結(jié)果一致。其次，sgRNA 的工作效率及脫靶效率直接影響基因編輯的成功率。Cho 等[23]認(rèn)為成對(duì)的Cas9 內(nèi)切酶共同作用于目標(biāo)基因組，會(huì)使脫靶效率明顯降低。在sgRNA 篩選中，本試驗(yàn)首先設(shè)計(jì)了3 條sgRNA，經(jīng)過(guò)噬斑形成試驗(yàn)，篩選到2條可以高效切割病毒基因的sgRNA，最后在噬斑克隆過(guò)程中，因?yàn)闆](méi)有標(biāo)簽，所以隨機(jī)篩選了10個(gè)單獨(dú)噬斑克隆。在這個(gè)過(guò)程中，要挑選相對(duì)于野生病毒噬斑稍小的噬斑克隆，突變毒株的噬斑會(huì)稍小于野生病毒[14]。同時(shí)，相比較于標(biāo)簽反向篩選，本試驗(yàn)沒(méi)有插入標(biāo)簽，因而后期就省去了刪除標(biāo)簽的步驟。

4 結(jié)論

綜上，本試驗(yàn)采用CRISPR/Cas9 第3 代基因編輯技術(shù)，快速對(duì)PRV-1 進(jìn)行編輯，確定了1對(duì)高效編輯PRVgE基因的sgRNA，并獲得1 株P(guān)RV-1-ΔgE。本研究提供了一種高效的PRV-1 毒株編輯方法，為后續(xù)構(gòu)建多基因缺失病毒提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為快速應(yīng)對(duì)PRV 變異及其相關(guān)變異株基礎(chǔ)研究提供了新思路。