（河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南鄭州 450008）

弓形蟲(chóng)?。╰oxoplasmosis）是由剛地弓形蟲(chóng)（Toxoplasma gondii）引起的一種專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生性原蟲(chóng)病，呈世界性流行[1]。該蟲(chóng)可感染人以及幾乎所有的溫血?jiǎng)游颷2]，被弓形蟲(chóng)感染的肉或未熟制的肉、奶等動(dòng)物性產(chǎn)品也會(huì)傳播該病，因而極大影響公共衛(wèi)生安全。據(jù)統(tǒng)計(jì)，歐洲豬弓形蟲(chóng)感染率可達(dá)64%[3]。正常人感染后一般呈隱性帶蟲(chóng)狀態(tài)，蟲(chóng)體在宿主體內(nèi)以包囊形式存在[4-5]。近年來(lái)，PCR技術(shù)在人及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物弓形蟲(chóng)病診斷中已有報(bào)道[6-8]，也有將PCR 技術(shù)用于豬弓形蟲(chóng)病診斷的研究[9-10]。豬感染弓形蟲(chóng)后往往會(huì)體溫升高，食欲減退，呼吸困難，甚至死亡，懷孕母豬會(huì)發(fā)生流產(chǎn)[11]。因此，利用簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，盡早對(duì)豬弓形蟲(chóng)病作出準(zhǔn)確診斷，對(duì)控制弓形蟲(chóng)病至關(guān)重要。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR）是一種新型診斷工具，具有敏感、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，并且在核酸快速擴(kuò)增的同時(shí)，可實(shí)現(xiàn)模板的定量測(cè)定[12-13]。本研究通過(guò)設(shè)計(jì)比較不同引物探針，建立了豬弓形蟲(chóng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)方法，以期為豬弓形蟲(chóng)病的診斷提供快速、敏感、特異的臨床檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 病毒（菌）株、臨床樣本

豬弓形蟲(chóng)感染病料，由河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心保存；滅活的2 型豬鏈球菌、2 型副豬嗜血桿菌，附紅細(xì)胞體、豬瘟病毒，豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2 型等，均由河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室保存并提供；豬弓形蟲(chóng)臨床樣品，為河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室采集河南各地市豬場(chǎng)樣品。

1.2 儀器設(shè)備與主要試劑

KingFisher 全自動(dòng)核酸提取儀，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司；DNA/RNA 磁珠提取試劑盒，購(gòu)自Abmion 公司；ABI 7500 熒光定量PCR 儀，購(gòu)自美國(guó)ABI 公司；ExTaqDNA 聚合酶、Rnase Inhibitor、DL 2 000 bp DNA Marker、DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒DNA 小量純化試劑盒等，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、pGEM-T easy 載體，均購(gòu)自Promega 公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)和合成

通過(guò)大量比對(duì)GenBank 中弓形蟲(chóng)基因序列，選取高度保守且具有型特異性的基因序列為模板，設(shè)計(jì)弓形蟲(chóng)特異性引物對(duì)和TaqMan MGB 探針。上游引物序列P1：CTGTGCACCCCCGGATAC；下游引物序列P2：TCCTGCGCTGCTTCCAAT；探針序列Probe-P3：FAM-TGCACTGGCTTCCA 。由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.4 模板制備

以豬弓形蟲(chóng)陽(yáng)性樣品為陽(yáng)性對(duì)照，水為陰性對(duì)照，采用磁珠法提取核酸，-20 ℃保存或直接用于后續(xù)PCR 擴(kuò)增。

1.5 豬弓形蟲(chóng)標(biāo)準(zhǔn)品制備

采用本實(shí)驗(yàn)室建立的豬弓形蟲(chóng)PCR 檢測(cè)方法[10]擴(kuò)增豬弓形蟲(chóng)基因片段，將弓形蟲(chóng)陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入pGEM-T Easy 載體中，篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒送寶生物工程（大連）有限公司，采用T7 和SP6 引物進(jìn)行測(cè)序。對(duì)測(cè)序正確的豬弓形蟲(chóng)重組陽(yáng)性質(zhì)粒，應(yīng)用分光光度計(jì)測(cè)定其OD260、OD280及OD260/OD280值，共重復(fù)5 次；參考Kim 等[14]介紹的方法計(jì)算其濃度。

1.6 FQ-PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化

將豬弓形蟲(chóng)制備的DNA 稀釋至終濃度1.0×105拷貝/μL 作為檢測(cè)模板，P1/P2 引物對(duì)和Probe-P3 探針?lè)謩e稀釋為終濃度0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 和1.0 μmol/L；應(yīng)用熒光定量PCR 儀，采用矩陣法篩選不同濃度的弓形蟲(chóng)引物和探針組合；對(duì)PCR 反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、PCR 各循環(huán)數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，獲得最低Ct 值和較高的熒光強(qiáng)度。

1.7 敏感性試驗(yàn)

將獲得的豬弓形蟲(chóng)DNA 分別作10 倍系列稀釋?zhuān)瑢NA 終濃度依次調(diào)整為1.0×106～1.0×100拷貝/μL，共7 個(gè)稀釋度，以水為陰性對(duì)照，按已優(yōu)化的FQ-PCR 反應(yīng)條件進(jìn)行豬弓形蟲(chóng)FQ-PCR 敏感性試驗(yàn)。

1.8 特異性試驗(yàn)

對(duì)豬鏈球菌2 型、副豬嗜血桿菌2 型、附紅細(xì)胞體、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2 型等提取核酸，同時(shí)將濃度為1.0×105拷貝/μL 的陽(yáng)性重組質(zhì)?；旌衔镒鳛殛?yáng)性對(duì)照，水為陰性對(duì)照，按優(yōu)化的FQ-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證該方法的特異性。

1.9 穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)

分別將4 個(gè)濃度的10 倍系列稀釋的豬弓形蟲(chóng)DNA（終濃度1.0×104～1.0×101）進(jìn)行FQ-PCR 擴(kuò)增，每個(gè)系列設(shè)定3 個(gè)重復(fù)，驗(yàn)證該方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

1.10 應(yīng)用試驗(yàn)

將建立的豬弓形蟲(chóng)FQ-PCR 方法與豬弓形蟲(chóng)普通PCR 檢測(cè)方法進(jìn)行比較。配制檢測(cè)試劑，以陽(yáng)性質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，水為陰性對(duì)照，對(duì)60 份臨床疑似豬弓形蟲(chóng)感染全血及肺臟樣品進(jìn)行檢測(cè)。首先對(duì)60 份樣品、陰陽(yáng)性對(duì)照用勻漿機(jī)研磨勻漿，5 000 r/min 離心5 min，取上清100 μL，用核酸提取儀提取核酸；利用建立的方法和豬弓形蟲(chóng)PCR檢測(cè)試劑及其檢測(cè)方法，對(duì)每個(gè)樣品和陰、陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)；最后，比較分析這兩種方法的檢測(cè)結(jié)果，并與測(cè)序結(jié)果比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品制備

結(jié)果（圖1）顯示，重組質(zhì)粒的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為272 bp，計(jì)算出的重組陽(yáng)性質(zhì)粒DNA 濃度為9.22×1010拷貝/μL。

圖1 豬弓形蟲(chóng)PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.2 反應(yīng)條件優(yōu)化

優(yōu)化的25 μL PCR 反應(yīng)體系中，豬弓形蟲(chóng)P1/P2 終濃度均為0.4 μmol/L，Probe-P3 終濃度為0.6 μmol/L，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，10×ExTaq酶緩沖液2.5 μL，5U/μL ExTaqDNA 酶0.25 μL，1.0×105拷貝/μL 的cDNA 模板各2 μL，補(bǔ)足去離子水至終體積25 μL。優(yōu)化的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃，5 min；94 ℃ 15 s，59 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。

圖2 豬弓形蟲(chóng)FQ-PCR 的擴(kuò)增曲線

2.3 敏感性試驗(yàn)

結(jié)果（圖3）顯示，F(xiàn)Q-PCR 檢測(cè)豬弓形蟲(chóng)的最低檢出限為1.0×101拷貝/μL，101～107拷貝/μL模板范圍內(nèi)的擴(kuò)增曲線有很好的線性關(guān)系。

圖3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 特異性試驗(yàn)

結(jié)果（圖4）顯示，豬弓形蟲(chóng)的檢測(cè)Ct 值為16.513 2，且出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線；但豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、附紅細(xì)胞體、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型均未出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線。

圖4 特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)

3 個(gè)濃度分別為1.0×104、1.0×103、1.0×102拷貝/μL 的豬弓形蟲(chóng)DNA 3 次試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，濃度為1.0 拷貝/μL 的豬弓形蟲(chóng)DNA 3 次試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，說(shuō)明建立的弓形蟲(chóng)FQ-PCR 方法具有很好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 FQ-PCR 穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

2.6 應(yīng)用試驗(yàn)

采用建立的豬弓形蟲(chóng)實(shí)時(shí)熒光PCR 方法，檢測(cè)60 份臨床疑似豬弓形蟲(chóng)感染全血及肺臟樣品，結(jié)果32 份樣品為豬弓形蟲(chóng)核酸陽(yáng)性；采用普通RT-PCR 檢測(cè)，結(jié)果29 份樣品為豬弓形蟲(chóng)核酸陽(yáng)性。應(yīng)用試驗(yàn)結(jié)果表明，建立的豬弓形蟲(chóng)實(shí)時(shí)熒光PCR 方法比普通PCR 方法的靈敏性高。該FQPCR 方法檢測(cè)結(jié)果與豬弓形蟲(chóng)基因測(cè)序結(jié)果符合率為100%，說(shuō)明建立的豬弓形蟲(chóng)實(shí)時(shí)熒光PCR 方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。

3 討論

MGB 探針的淬滅基團(tuán)采用非熒光淬滅基團(tuán)，本身不產(chǎn)生熒光，可以大大降低本底信號(hào)的強(qiáng)度，同時(shí)探針上還連接有MGB 修飾基團(tuán)，可以將探針的Tm 值提高10 ℃左右，因此為了獲得同樣的Tm值，MGB探針可以比普通TaqMan探針設(shè)計(jì)得更短，從而既降低了合成成本，也使得探針設(shè)計(jì)成功率大為提高；而且TaqMan-MGB 探針特異性好，敏感性更高。所以，本研究采用了TaqMan-MGB 探針，以達(dá)到更加特異、敏感的豬弓形蟲(chóng)檢測(cè)效果。

豬弓形蟲(chóng)特異PCR 診斷的遺傳標(biāo)記主要有B1基因、ITS序列、529 bp 重復(fù)序列、致密顆粒蛋白、SAG1基因等。SAG1是弓形蟲(chóng)的主要表面抗原基因，表達(dá)的蛋白約占蟲(chóng)體蛋白總量的3%～5%，能被弓形蟲(chóng)感染急性期或恢復(fù)期血清抗體識(shí)別，是誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的主要靶抗原。本實(shí)驗(yàn)室在2007年就建立了以豬弓形蟲(chóng)核糖體DNA 第一內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS1）序列為模板設(shè)計(jì)引物，建立了豬弓形蟲(chóng)病特異PCR 診斷方法[10]。該法可從基因組DNA中擴(kuò)增出272 bp 的目的片段，特異性好、敏感性高，最低能檢測(cè)到的弓形蟲(chóng)DNA 量為0.001 ng，且與相關(guān)的9 種對(duì)照寄生蟲(chóng)、細(xì)菌和病毒無(wú)交叉反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)室在此基礎(chǔ)上根據(jù)弓形蟲(chóng)ITS1基因設(shè)計(jì)TaqMan-MGB 引物和探針，建立了診斷弓形蟲(chóng)病特異性的FQ-PCR 方法。試驗(yàn)結(jié)果顯示：該法最低能檢測(cè)到10 拷貝/μL 的豬弓形蟲(chóng)DNA，且與寄生于豬體內(nèi)的7 種常見(jiàn)微生物無(wú)交叉反應(yīng)；該檢測(cè)方法相比普通PCR 檢測(cè)方法，即提高了敏感性，又節(jié)約了時(shí)間，而且能夠?qū)怂崞芜M(jìn)行相對(duì)定量。

臨床上豬弓形蟲(chóng)常與其他病原，如豬附紅細(xì)胞體、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2 型、豬鏈球菌2 型等發(fā)生混合感染。這些病原感染引起的臨床癥狀類(lèi)似，而且混合感染后引起的病死率大大增加，因此需要借助實(shí)驗(yàn)室診斷才可以鑒別。此外，許多豬群感染豬弓形蟲(chóng)后可以不表現(xiàn)明顯臨床癥狀而處于潛伏感染狀態(tài)，但一旦外界環(huán)境改變或患其他疾病或機(jī)體抵抗力降低，則會(huì)引起疫病發(fā)生。因此，建立弓形蟲(chóng)病原檢測(cè)方法，對(duì)于該病的早期診斷、檢測(cè)、防治及豬群凈化非常必要。弓形蟲(chóng)病原學(xué)涂片檢測(cè)僅適合于弓形蟲(chóng)病急性暴發(fā)性病例的死后診斷，而對(duì)慢性感染或經(jīng)藥物治療后的病例意義不大，容易造成漏檢。血清學(xué)診斷對(duì)臨床病例的確診沒(méi)有太大意義，而FQ-PCR檢測(cè)方法能夠在2 h 內(nèi)對(duì)弓形蟲(chóng)病進(jìn)行診斷，因此PCR 方法是檢測(cè)豬弓形蟲(chóng)病的最佳方法。

對(duì)60 份疑似豬弓形蟲(chóng)感染的臨床樣品進(jìn)行FQ-PCR 檢測(cè)，結(jié)果有32 份樣品呈陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率為53.3%，其中全血樣品中，15 份為陽(yáng)性，肺臟組織樣品中，17 份為陽(yáng)性，說(shuō)明利用PCR 方法對(duì)活體豬全血樣品和病死豬臟器樣品均能進(jìn)行豬弓形蟲(chóng)病檢測(cè)。本研究建立的FQ-PCR 檢測(cè)方法具有高度敏感性，試驗(yàn)證明對(duì)整個(gè)病豬肺臟組織均能成功檢測(cè)，說(shuō)明該方法適于臨床檢測(cè)。

臨床出現(xiàn)混合及隱性感染時(shí)，病原含量相對(duì)較低，采用其他臨床檢測(cè)方法不容易檢測(cè)到病原，而本研究建立的豬弓形蟲(chóng)FQ-PCR 檢測(cè)方法最低檢出限可達(dá)1.0×101拷貝/μL，即使病原含量較低，也可準(zhǔn)確檢測(cè)區(qū)分。

4 結(jié)論

本研究設(shè)計(jì)了豬弓形蟲(chóng)特異性引物對(duì)和探針，優(yōu)化篩選了最佳引物探針濃度組合，最終成功建立了豬弓形蟲(chóng)實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法。本方法特異性好，能高效擴(kuò)增目的基因，而對(duì)其他病原核酸無(wú)擴(kuò)增；敏感性好，最低能檢測(cè)到1.0×101拷貝/μL。本研究建立的豬弓形蟲(chóng)實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法是一種簡(jiǎn)便、快速，特異性和敏感性較高的診斷方法，可用于豬弓形蟲(chóng)的快速檢測(cè)及鑒別診斷。