郭永麗，張 君，孫 剛，高明春

（1.黑龍江省疾病預(yù)防與控制中心，黑龍江哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150030）

副結(jié)核病又稱約翰氏病（JD），是一種慢性、傳染性肉芽腫性腸炎，表現(xiàn)為患病動(dòng)物持續(xù)腹瀉、體重減輕、生產(chǎn)力下降，最終死亡，可對社會(huì)經(jīng)濟(jì)、動(dòng)物福利和公共衛(wèi)生產(chǎn)生重要影響。為此，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為須通報(bào)動(dòng)物疫病，我國將其列為二類動(dòng)物疫病。目前，本病廣泛流行于世界各國，特別是一些牛羊養(yǎng)殖業(yè)較發(fā)達(dá)的國家。對48 個(gè)國家進(jìn)行副結(jié)核病調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大約50%的國家超過20%的牛群和羊群患有副結(jié)核病[1]。近年來有研究[2]表明，副結(jié)核病的病原可能與人類疾病關(guān)系密切，在50%的以持續(xù)性腹瀉為特征的克羅恩病患者血液中可分離出副結(jié)核病病原。為及時(shí)診斷并防控該病，本文主要從病原學(xué)、危害及流行現(xiàn)狀、診斷、疫苗和防控措施等方面，對副結(jié)核病進(jìn)行概述。

1 病原學(xué)

副結(jié)核病是由鳥分枝桿菌亞種副結(jié)核亞種（MAP）感染所引起的。MAP 能夠感染所有反芻動(dòng)物（如牛、羊、美洲駝、鹿等），其中牛感染最為常見，通常在幼齡期（斷奶前）感染，并且大部分3 歲以上才表現(xiàn)臨床癥狀。據(jù)報(bào)道[3]，雜食動(dòng)物和食肉動(dòng)物（如野兔、狐貍、鼬鼠、豬）以及非人類靈長類動(dòng)物也可感染MAP 。

MAP 是一種特殊的細(xì)胞內(nèi)病原體，只能在易感動(dòng)物的宿主細(xì)胞內(nèi)繁殖，但能夠在宿主環(huán)境以外的惡劣條件下長期存活。受感染的牲畜可不定期通過排便、泌乳排放病原體，造成MAP 的糞-口傳播，這也被認(rèn)為是主要的感染途徑[4]。

2 危害及流行分布

副結(jié)核病造成經(jīng)濟(jì)損失的因素包括產(chǎn)奶量下降、屠宰價(jià)值降低、被動(dòng)淘汰增加、產(chǎn)犢間隔延長、久配不育以及診斷與潛在的治療費(fèi)用。在美國受MAP 感染的奶牛群中，每頭奶牛每年的經(jīng)濟(jì)損失估計(jì)為21～79 美元[5-6]；1996 年，美國因MAP感染導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量減少，由此引起的經(jīng)濟(jì)損失為（2±1.6）億美元[7]。在澳大利亞、加拿大、法國和英國奶牛群中，每頭奶牛每年的經(jīng)濟(jì)損失估計(jì)分別為45～88 澳元、49 加元、234 歐元和27 英鎊[8-11]。有關(guān)其他物種感染MAP 的經(jīng)濟(jì)損失報(bào)道較少。副結(jié)核病對英國綿羊業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失估計(jì)為每年40 萬～3 200 萬英鎊[12]；MAP 感染使意大利奶羊場的利潤效率從84%下降到64%[13]。此外，MAP 與人類克羅恩病之間的關(guān)系一直是爭論的熱點(diǎn)[14]。從副結(jié)核病牛與克羅恩病人腸道感染癥狀的相似性以及克羅恩病患者體內(nèi)大多能分離到MAP 來分析，副結(jié)核病具有潛在的人獸共患傳染病風(fēng)險(xiǎn)，它對公共衛(wèi)生的影響意義重大[15]。

副結(jié)核病呈世界性分布，美國、英國、加拿大、澳大利亞、愛爾蘭等國家均有該病流行。在美國至少22%的牛場中，有超過10%的牛感染MAP[16]。在歐洲，牛感染MAP 的患病率約為20%；在瑞士和西班牙，綿羊和山羊感染MAP 的患病率均超過20%[17]；在新西蘭，69%的農(nóng)場至少有1 頭動(dòng)物MAP 檢測呈陽性[18]。在英國，MAP 的牧場感染率為59%～77%[19]。

我國1953 年于內(nèi)蒙古首次發(fā)現(xiàn)副結(jié)核病，隨后在黑龍江省、吉林省、河北省等地均有該病暴發(fā)，幾乎覆蓋我國北方大部分地區(qū)[20]。2012 —2014 年對西藏部分地區(qū)的468 份牦牛血清進(jìn)行MAP 抗體檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)總體陽性率為1.92%[21]。2015 年MAP 抗體檢測結(jié)果顯示，內(nèi)蒙古、黑龍江省、湖北省、四川省、安徽省、江蘇省規(guī)?；翀鲋械呐AP 抗體陽性率分別為2.09%、3.90%、2.05%、5.23%、8.00%、1.22%[22]。2014—2015 年采集的3 600 份牛血清樣品MAP 抗體檢測顯示，MAP 抗體平均陽性率為2.29%，其中山西、西藏、新疆、河北、青海、重慶、湖北等?。ㄊ袇^(qū)）的MAP抗體陽性率分別為3.75%、3.5%、2.2%、2.0%、1.5%、0.75%、0.5%[23]。

3 診斷

由于病原的特殊性，MAP 感染后機(jī)體的免疫反應(yīng)較為復(fù)雜，需要結(jié)合不同感染階段的特征以及動(dòng)物群體的實(shí)際情況，靈活使用不同的檢測方法進(jìn)行持續(xù)追蹤，以尋找適合不同時(shí)期的檢測方法。

3.1 亞臨床期診斷

亞臨床期診斷的主要目的是在感染動(dòng)物表現(xiàn)臨床癥狀前做到早期確診。有效的診斷方法應(yīng)能從外表健康的動(dòng)物中區(qū)分出感染動(dòng)物[24]，并揭示其是否及何時(shí)具有傳染性[25]。雖然可以通過MAP 特異性PCR 來檢測糞便排菌情況，從而確定動(dòng)物是否感染MAP，卻不能顯示何時(shí)具有傳染性。這種診斷方法在流行率低的動(dòng)物群體中根除副結(jié)核病是有效的[26]。檢測?？贵w反應(yīng)的新型MAP 分泌蛋白SF2 抗原可用于MAP 感染的早期或亞臨床階段[27]。IFN-γ 釋放試驗(yàn)可用于檢測細(xì)胞免疫介導(dǎo)的早期MAP 感染[28]，但副結(jié)核菌素抗原成分的復(fù)雜性會(huì)影響到檢測的特異性，所以需要對其進(jìn)行改進(jìn)和標(biāo)準(zhǔn)化[29]。

3.2 臨床期診斷

臨床期診斷主要針對體液免疫反應(yīng)，如ELISA 檢測MAP 抗體。犢牛、羔羊感染MAP 后需要經(jīng)較長的時(shí)間（1 年以上）才能產(chǎn)生ELISA抗體，而在新生動(dòng)物中，較早檢測出的ELISA抗體可能是由于吸收了初乳中的母源抗體所導(dǎo)致的[30]。ELISA 的滴度可以預(yù)測MAP 排菌的概率，這在通過清除感染牛來減少傳播進(jìn)而控制牛群副結(jié)核病時(shí)較為實(shí)用。此種情況下，ELISA 可以代替糞便培養(yǎng)（PFC）或糞便PCR（IFC）檢測，但是縮短檢測間隔時(shí)間很重要[31]。

3.3 整群監(jiān)測診斷

環(huán)境采樣檢測是一種用于確定群體MAP 感染狀況的快速診斷方法，然而這種采樣方法僅在相對密集的家畜飼養(yǎng)作業(yè)（如奶牛飼養(yǎng)）中足夠敏感[32]。在放牧飼養(yǎng)（如綿羊和牛群）、環(huán)境采樣檢測中就沒有足夠的敏感性[33]。PCR 檢測相較于混合環(huán)境樣品的培養(yǎng)，不僅可減少處理時(shí)間和成本，而且檢測不依賴于樣本中的活菌量，所以會(huì)有更高的靈敏度，尤其在冬季或在肥料積累時(shí)間過長的地方采集的樣品。

使用商品化ELISA 或PCR 檢測大缸奶/混合奶樣是方便價(jià)廉的奶牛副結(jié)核病整群篩查方法。為確定牛群的MAP 感染狀況，可以使用ELISA 或者直接PCR 檢測大缸奶中的MAP 特異性抗體或者M(jìn)AP 抗原。大缸奶檢測在短期內(nèi)的一致性較高，但長期可能會(huì)受到畜群規(guī)模和ELISA 陽性個(gè)體MAP 流行率的影響[34]。

4 疫苗

理想的MAP 疫苗不僅能夠預(yù)防感染，保持陰性群體無MAP，還能夠保護(hù)高流行率群體中的年輕和易感動(dòng)物。研發(fā)MAP 疫苗的一個(gè)關(guān)鍵在于能夠引發(fā)抗感染免疫保護(hù)反應(yīng)?，F(xiàn)有疫苗可部分降低感染性或糞便中MAP 排菌量，延長感染動(dòng)物的潛伏期，減緩MAP 排菌量由低向高發(fā)展，或降低副結(jié)核病臨床病例的累積發(fā)病率，但對預(yù)防MAP 感染無效[35-38]。菌苗、亞單位疫苗和載體疫苗也已研發(fā)上市，但效果均不理想[39-42]。減毒活疫苗（LAV）的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，它們能夠刺激細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)。LAV 在小鼠模型中產(chǎn)生了強(qiáng)大的保護(hù)作用[43]，但在山羊模型中的研究[44]表明，LAV 未顯示有保護(hù)作用；另有研究[45]表明，LAV可以顯著減少糞便排菌量。LAV 尚未在牛模型中進(jìn)行試驗(yàn)。此外，單基因敲除株可能不是最佳的候選疫苗，因?yàn)樗鼈兊臏p毒程度不足以刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)進(jìn)而消除疾病。

Gudair 疫苗已廣泛應(yīng)用于澳大利亞綿羊群，并已成為控制副結(jié)核病的主要措施。使用這種滅活疫苗降低了澳大利亞綿羊群MAP 感染和糞便排菌引起的流行率，并大大降低了死亡率[46-47]。但這種疫苗不能預(yù)防MAP 感染，且不良反應(yīng)也較大，單獨(dú)應(yīng)用不能根除MAP 感染[36]。與綿羊相比，牛尚無有效的疫苗，而缺乏有效防止MAP 感染的疫苗是牛副結(jié)核病控制計(jì)劃進(jìn)展緩慢的一個(gè)主要因素。在全球范圍內(nèi)，無論是活疫苗（Neoparasec）還是滅活疫苗（Mycopar，ID Lelystad，Gudair，Silirum），大多都是以礦物油佐劑配制的MAP 菌株316F 為基礎(chǔ)的，其中只有Mycopar 疫苗在美國獲得許可，且僅用于5%的美國乳品經(jīng)營牧場[48]。Mycopar 疫苗受到當(dāng)?shù)孬F醫(yī)機(jī)構(gòu)的嚴(yán)格控制，因?yàn)樵跇?biāo)準(zhǔn)牛結(jié)核病檢測中接種疫苗的牛更容易出現(xiàn)結(jié)核病假陽性[49]。

5 防控措施

目前世界上對副結(jié)核病尚無有效的治療措施。雖然鏈霉素、異煙肼、利福平等藥物可以減輕或緩解與MAP 感染相關(guān)的臨床癥狀（主要是體重減輕和腹瀉），并有助于延長動(dòng)物的壽命，但對副結(jié)核病的治愈沒有任何效果[50]。此外藥物的長期使用不僅會(huì)讓病原體對藥物產(chǎn)生耐藥性，更會(huì)增加藥物在機(jī)體內(nèi)的殘留。疫苗的使用雖然可以減少副結(jié)核病臨床癥狀的發(fā)生，但是仍然無法徹底防止病畜向外界排菌，并且在接種后無法通過檢測來鑒別免疫動(dòng)物和感染動(dòng)物，而處于亞臨床期的感染動(dòng)物持續(xù)向外界排菌會(huì)帶來更大的安全隱患[51]。副結(jié)核病的防控需要根據(jù)不同目標(biāo)（減少患病率還是根除MAP），采取不同的防控策略，如撲殺攜帶MAP的動(dòng)物，采用減少新生兒/幼畜感染的衛(wèi)生措施以及接種疫苗等[1]。由于副結(jié)核病是一種慢性消耗性疾病，臨床表現(xiàn)最早出現(xiàn)在1～2 歲，一般出現(xiàn)在4歲以后，所以建議副結(jié)核病的防控周期至少為5 年。

5.1 清除MAP 感染牛

盡早識(shí)別并清除MAP 感染動(dòng)物、減少糞便排菌污染環(huán)境，可以切斷MAP 感染其他易感動(dòng)物尤其是新生動(dòng)物的途徑。撲殺已知MAP 感染牛的后代也是清除MAP 感染的一種措施，因?yàn)樘涸谧訉m內(nèi)感染MAP 的概率很高[52]。自2006年起，國際通用2 種副結(jié)核病控制程序，即大缸奶質(zhì)量保證措施（bulk milk quality assurance programme，BMQAP）與密集副結(jié)核程序（intensive paratuberculosis programme，IPP）。IPP 于1998 年推出，目標(biāo)是從受感染的牛群中根除副結(jié)核病，并在經(jīng)認(rèn)證的無副結(jié)核病牛群中進(jìn)行低風(fēng)險(xiǎn)貿(mào)易[53]。但是，農(nóng)場主對這一方案的參與率很低，因?yàn)樵摲桨傅馁M(fèi)用相對較高。因此，2006 年啟動(dòng)了一項(xiàng)新的更經(jīng)濟(jì)的BMQAP 策略，旨在減少人類通過乳制品接觸MAP。該策略要求降低運(yùn)送到加工廠的牛奶中的MAP 滴度低于103PFU/L[54]。

防控策略中對檢測后牛群的狀態(tài)進(jìn)行了分類?！盃顟B(tài)A”指MAP 檢測陰性群，“狀態(tài)C”為MAP檢測陽性群，“狀態(tài)B”是“狀態(tài)C”牛群在撲殺所有MAP 陽性動(dòng)物后的狀態(tài)。包括荷蘭在內(nèi)的幾個(gè)國家規(guī)定乳品加工廠收購的牛奶至少要來源于“狀態(tài)B”牧場。當(dāng)牧場處于“狀態(tài)C”時(shí)，加工廠不允許收購其產(chǎn)出的牛奶。

5.1.1 IPP 執(zhí)行IPP 策略的牧場要進(jìn)行5 個(gè)年度評(píng)估：第1 年評(píng)估，采用血清ELISA 和IFC 檢測所有≥2 或3 歲牛，第2～5 年評(píng)估，均采用PFC或IFC 檢測所有≥2 或3 歲牛。在5 個(gè)年度牧場評(píng)估測試中均為陰性的牧場可被定義為MAP 陰性牧場，反之則為陽性場，需要重新進(jìn)行5 個(gè)年度牧場評(píng)估測試。因此，牧場最短可在5 年獲得無MAP陰性牧場認(rèn)證。陰性場認(rèn)證后，每2 年對MAP 陰性牛群所有≥2 歲牛進(jìn)行1 次糞便混合樣本PFC監(jiān)測，陽性場則需對混合樣本中每個(gè)樣本每年重新逐一進(jìn)行IFC 檢測[54]（圖1）。

5.1.2 BMQAP BMQAP 相對IPP 而言，程序簡單易行，所有的評(píng)估檢測都可以只依靠ELISA 來完成。執(zhí)行BMQAP 策略的牧場，在最初的評(píng)估和監(jiān)測程序中，ELISA 結(jié)果可通過PFC 來驗(yàn)證。檢測為陰性的牧場被暫定為無MAP 感染牧場，進(jìn)入到每2 年1 次的牛群ELISA 監(jiān)測程序[54]；為陽性的牧場，每年對所有≥3 歲的牛，實(shí)行MAP 陽性動(dòng)物淘汰處理，一直到檢測不到陽性動(dòng)物為止（圖1）。

圖1 IPP 和BMQAP 控制策略

5.2 減少新生動(dòng)物MAP 感染

加強(qiáng)農(nóng)場生物安全，特別是在飼養(yǎng)幼畜期間，防止畜群內(nèi)MAP 傳播的主要干預(yù)策略是防止新生動(dòng)物接觸成年動(dòng)物的糞便[55]。動(dòng)物出生后應(yīng)立即隔離，避免糞-口傳播，改善產(chǎn)犢區(qū)的衛(wèi)生和初乳/牛奶喂養(yǎng)的管理。

5.3 避免引進(jìn)MAP 感染牛

保護(hù)MAP 陰性畜群免受MAP 感染及避免引入MAP 感染動(dòng)物。而購買亞臨床感染的動(dòng)物被認(rèn)為是群體間傳播的主要因素[56]。此外，避免引進(jìn)MAP 感染動(dòng)物的精液也是預(yù)防MAP 感染的必須舉措。

6 結(jié)語

對于副結(jié)核病，OIE 目前還沒有推薦的檢測方法。ELISA 法和分子生物學(xué)法雖然具有較大的優(yōu)勢，但不能有效區(qū)分感染動(dòng)物處于何種階段。對于副結(jié)核病的預(yù)防，需加快新型疫苗的研發(fā)制備，減少疫苗副作用及檢測干擾。針對薄弱環(huán)節(jié)加快技術(shù)創(chuàng)新，尋求更加方便、高效、快捷的檢測方法尤為重要。

總體而言，副結(jié)核病的流行傳播是困擾全世界的一個(gè)重大問題，其對公共衛(wèi)生安全的威脅迫使很多MAP 感染國都提出了本國的副結(jié)核病根除計(jì)劃。我國副結(jié)核病防治任重道遠(yuǎn)，需要強(qiáng)化政府領(lǐng)導(dǎo)和各部門職責(zé)，強(qiáng)化與衛(wèi)生部門信息交流，加強(qiáng)副結(jié)核病防控宣傳教育，提高牧場工作者及普通民眾對副結(jié)核病的認(rèn)識(shí)和重視。