趙俊杰，李 建，李偉杰，姚文生，李 陽，王團結

（1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032）

豬丹毒（swine erysipelas）是由紅斑丹毒絲菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）引起的傳染性疾病。近年來，豬丹毒由散發(fā)逐漸呈流行暴發(fā)態(tài)勢，對我國部分地區(qū)造成嚴重的經(jīng)濟損失。同時，作為人獸共患病，動物攜帶病原感染人的病例接連不斷，嚴重威脅公共衛(wèi)生安全和動物源性食品安全[1-2]。

目前，在市場流通環(huán)節(jié)有豬丹毒活疫苗和滅活疫苗?；钜呙缫愿玫拿庖弑Ｗo效果受到廣大養(yǎng)殖場戶的青睞，為防控豬丹毒發(fā)揮了重要作用。根據(jù)《中華人民共和國獸藥典》（2015 年版三部）（以下稱《獸藥典》）規(guī)定，豬丹毒活疫苗安全檢驗使用小鼠或豬進行。從動物試驗替代原則和經(jīng)濟成本考慮，優(yōu)先使用小動物替代大動物開展檢驗。原豬丹毒活質量標準自1985 年提出至今，雖經(jīng)修訂，但是隨著活株疫苗生產(chǎn)代次的提高，使用小鼠進行安全檢驗的結果穩(wěn)定性可能會出現(xiàn)問題。同時，影響小鼠免疫反應的幾種因素對豬丹毒活疫苗安全檢驗的影響也不清楚。本研究選用豬丹毒活疫苗（GC42 株），探索小鼠不同品系、性別及體重對安全檢驗的影響，以期為豬丹毒活疫苗質量標準修訂以及企業(yè)生產(chǎn)檢驗提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

本試驗所用豬丹毒活疫苗（GC42 株，產(chǎn)品批號19053001）及20%鋁膠生理鹽水，均購自廣西麗原生物股份有限公司；活菌計數(shù)使用的馬丁肉湯和馬丁瓊脂，均購自北京中海生物科技有限公司。

1.2 實驗動物

本試驗所用SPF 級小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.3 活菌計數(shù)

鋪平板：將馬丁瓊脂融化待溫度降至50 ℃左右，按比例加入10%血清后，灌制平板，平板正置放在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜，無雜菌生長為合格，待用。

連續(xù)稀釋與滴平板：按質量標準要求每頭份樣品應至少含有的活菌數(shù)以及樣品標示的頭份數(shù)計算樣品稀釋倍數(shù)。本樣品為50 頭份的豬丹毒活疫苗凍干苗，每批隨機抽樣3 瓶，首先分別加入40 mL馬丁肉湯充分溶解，各取1 mL 菌液與9 mL 馬丁肉湯進行10 倍系列稀釋，稀釋至10-6稀釋度，取10-6稀釋度菌液接種在制備好的含10%血清的馬丁瓊脂上，每瓶樣品接種平板3 個，0.1 mL/個，使菌液均勻散開，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，待平板晾干后，倒置平板，培養(yǎng)48 h。

計算菌數(shù)：肉眼觀察平板菌落，并在平板底面點數(shù)，算出每個樣品的3 個平板的平均菌落數(shù)，計算出每頭份疫苗中含有的活菌數(shù)（CFU）。

1.4 安全檢驗

1.4.1 檢驗方法 《獸藥典》豬丹毒活疫苗質量標準規(guī)定，若選用小鼠進行安全檢驗，需要符合下述要求：按照疫苗標簽注明頭份，將疫苗用20%氫氧化鋁膠生理鹽水稀釋，皮下注射體重20～22 g小鼠10 只，皮下注射10 只，各2 頭份，觀察14 d。注射GC42 疫苗的小鼠應全部健活。否則，需用小鼠按照上述方法重檢1 次，如果仍不符合規(guī)定，可用豬檢驗1 次。

1.4.2 試驗分組

1.4.2.1 小鼠不同品系對安全檢驗的影響 本試驗采用4 種品系小鼠分別為KM、ICR、C57BL/6N和BALB/c，每組10 只，分別按照上述檢驗方法注射2、6 和10 頭份，重復3 次試驗。同時，小鼠體重均位于20～22 g 之間，全部為雌性。

1.4.2.2 小鼠不同性別對安全檢驗的影響 本試驗采用雌性和雄性ICR 小鼠（體重20～22 g），每組10 只，分別按照上述檢驗方法注射2、6 和10頭份，重復3 次試驗。

1.4.2.3 小鼠不同體重對安全檢驗的影響 本試驗采用13～14、21～22 和29～30 g 雌性ICR 小鼠，每組10 只，分別按照上述檢驗方法注射2、6 和10 頭份，重復3 次試驗。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析（ANONA），P＜0.05 為差異顯著。

2 試驗結果

2.1 豬丹毒活疫苗（GC42 株）活菌計數(shù)

由表1 可知，活菌計數(shù)結果以每批產(chǎn)品3 瓶樣品中含活菌數(shù)的最小值為最終結果，豬丹毒活疫苗（GC42 株）的活菌計數(shù)結果為11.2×108CFU/頭份，符合《獸藥典》中豬丹毒活疫苗活菌計數(shù)中含GC42 活菌應不低于7.0×108CFU/頭份的要求。

表1 活菌計數(shù)結果

2.2 小鼠不同品系對豬丹毒活疫苗（GC42 株）安全評價的影響

由表2 可知，按照《獸藥典》的要求，KM、ICR、C57BL/6N 和BALB/c 小鼠接種2 頭份豬丹毒活疫苗（GC42 株）安全評價一次性通過率均為100%。但是在6 頭份和10 頭份劑量免疫時，4 種品系小鼠出現(xiàn)差異：KM 小鼠在6 頭份劑量組仍保持33.3%通過率；ICR 小鼠在6 頭份和10 頭份組一次性通過率為0；C57BL/6N 品系小鼠在3 個劑量組未出現(xiàn)小鼠死亡，一次性通過率為100%；BALB/c 小鼠在6 頭份和10 頭份組一次性通過率為0，且小鼠死亡率顯著高于其他各組（P＜0.05）。

2.3 小鼠不同性別對豬丹毒活疫苗（GC42 株）安全評價的影響

由表3 可知，在2 頭份免疫組，雄性組小鼠出現(xiàn)1 例小鼠死亡，雌性組小鼠3 次試驗全部合格；在6 頭份和10 頭份組，小鼠死亡數(shù)量均超過了質量標準要求，同時可見，10 頭份組雄性小鼠死亡率顯著高于雌性組（P＜0.05）。

2.4 不同體重小鼠對豬丹毒活疫苗（GC42 株）安全評價的影響

由表4 可知，21～22 和29～30 g 小鼠免疫2 頭份一次性通過率為100%。隨著小鼠體重增加，各免疫組小鼠死亡率呈下降趨勢。

表2 小鼠不同品系對豬丹毒活疫苗（GC42 株）安全評價的影響

表3 小鼠不同性別對豬丹毒活疫苗（GC42 株）安全評價的影響

表4 小鼠不同體重對豬丹毒活疫苗（GC42 株）安全評價的影響

3 討論

疫苗安全性評價既有疫苗所含抗原本身對實驗動物引起的特異性反應，也包含疫苗內的其他成分對機體引發(fā)的毒性反應。在進行安全性評價試驗時，應在動物死亡時判定是否屬于疫苗本身導致的死亡[3]。小鼠是獸用生物制品安全評價最常用的實驗動物之一，其穩(wěn)定性對疫苗安全檢驗或評價至關重要，而實際工作中發(fā)現(xiàn)試驗結果常出現(xiàn)結果不穩(wěn)定、可重復性差等問題。本研究聚焦小鼠品系、性別及體重等諸多因素，比較其對豬丹毒活疫苗（GC42）免疫反應的差異。

動物對各類細菌、病毒等微生物的易感性取決于其主要組織相容性復合體（MHC）。不同品系小鼠對同一微生物的免疫反應可能存在明顯差異，如帶等位基因H-2b 的小鼠（如C57BL/6N）比帶有等位基因H-2k 的小鼠（如C58、C3H）抵抗力強。BALB/c 小鼠極易受到假單胞菌強毒株的感染，而C57BL/6N 小鼠則具有一定抵抗力[4]。本研究表明，C57BL/6N 小鼠對豬丹毒活疫苗（GC42株）的耐受力較其他三種品系小鼠最強，而同為近交系的BALB/c 小鼠最為敏感，試驗1 數(shù)據(jù)顯示該組小鼠死亡率100%。按照《獸藥典》關于豬丹毒活疫苗安全檢驗規(guī)定，接種2 頭份劑量小鼠不能出現(xiàn)因疫苗導致的死亡。本研究證明，4 種品系小鼠均可通過豬丹毒活疫苗（GC42 株）安全檢驗。

性別也是遺傳因素的重要方面。通常認為，雌鼠產(chǎn)生抗體水平通常高于雄鼠，并且維持時間也比雄性小鼠較長。同時，性激素作為內分泌網(wǎng)絡的重要一部分與免疫系統(tǒng)存在一定關聯(lián)[5]。本研究比較了ICR 小鼠雌性和雄性對不同劑量的豬丹毒活疫苗（GC42 株）的耐受能力，結果顯示，在2 頭份和6 頭份劑量組雌性和雄性小鼠均未出現(xiàn)顯著差異，但是在10 頭份劑量組，雄性小鼠死亡率顯著高于雌性小鼠。

在獸用生物制品評價中選擇日齡適宜的實驗動物是非常重要的。幼齡小鼠免疫系統(tǒng)機能發(fā)育不完善或機能很弱，但是成年后隨年齡增加免疫反應的活性也減弱[6-7]。本研究還探索了13～14 g 規(guī)格小鼠對豬丹毒活疫苗（GC42 株）最為敏感，死亡率顯著高于其他各組，無法用于該疫苗的安全檢驗。隨著體重增加，ICR 小鼠對超劑量豬丹毒活疫苗的耐受力也逐漸增加。