王毅超 謝姣貴 潘印 朱杰 楊合慧 朱韜 李招云

乳腺癌是全世界婦女最常見的腫瘤之一，其發(fā)病率位居女性腫瘤的第2位[1]。目前我國女性乳腺癌發(fā)病率呈明顯的增長趨勢，預計至2021年，中國將有超過220萬例女性罹患乳腺癌[2]。目前關于乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制尚未完全闡明，且缺少可靠、準確的分子標志物用于早期診斷、動態(tài)監(jiān)測及預后分析；因此，探討乳腺癌進展的相關分子機制，尋找新的腫瘤標志物已經成為乳腺癌研究的重點和難點。自噬是真核細胞生物中進化保守地對細胞內物質進行周轉的重要過程，是細胞內一種通過溶酶體降解長壽命蛋白和受損細胞器的代謝途徑[3-4]。自噬可減少缺氧誘發(fā)的腫瘤壞死，抑制炎癥細胞浸潤，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5-6]。微小RNA（microRNA，miRNA）是生物體內普遍存在且進化上高度保守的一類非編碼小分子RNA，可通過調節(jié)靶基因，參與轉錄后基因表達調控，細胞的增殖、分化、凋亡，個體發(fā)育及新陳代謝等生理活動[7]。研究顯示，miRNA-224-5p在腫瘤組織、外周血或細胞中的表達譜明顯不同于正常組織或細胞[8]。因此，本研究測定了乳腺癌患者血清中miRNA-224-5p的表達，并探討乳腺癌細胞中miRNA-224-5p對自噬活性的影響。

1 對象和方法

1.1 對象 收集臺州市中心醫(yī)院2017年1月至2018年9月收治且行手術治療的40例乳腺癌女性患者（乳腺癌組）及同期性別、年齡相匹配的40例健康體檢者（健康對照組）的血液樣本。乳腺癌組患者年齡（49.5±10.6）歲；癌胚抗原水平（20.37±15.21）kU/L；CA153 水平為（33.18±10.56）μg/L；腫瘤位置：右乳 14 例，左乳 26例；手術類型：乳腺癌保乳術22例，改良乳腺癌根治術15例，腫塊切除術2例，單純乳房切除術1例；術后病理檢查：Luminal A型11例，Luminal B型19例，三陰性6 例，Her-2（3+）2 例，Her-2（2+）2 例；合并高血壓 5 例，糖尿病1例；均無飲酒史或吸煙史。健康對照組年齡（48.0±9.0）歲。本研究經醫(yī)院倫理委員會審查批準，兩組對象或家屬均簽署知情同意書。

1.2 材料 DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，Trizol試劑盒購自美國 Invitrogen 公司，LC3 抗體（L7543，1∶2 000）購自美國 Sigma 公司，SQSTM1/p62（sc-28359，1∶500）購自美國Santa cruz公司；實驗所用質粒購自蘇州吉馬基因公司。

1.3 血清miRNA-224-5p表達檢測 采用實時定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（qRT-PCR）。使用Trizol試劑盒提取血清總RNA，采用RNA 6000 Nano LabChip Kit（安捷倫）和Bioanalyzer 2100測定RNA的純度和濃度，然后置于-80℃冰箱內備用。使用Fastking cDNA第一鏈合成試劑盒（北京天根生化科技有限公司），嚴格按照說明書操作，配置為20μl的體系，將提取到的核糖核苷酸反轉錄為互補的第一鏈DNA。使用Super Real PreMIix Plus（北京天根生化科技有限公司）和ABI7300 Plus系統(tǒng)進行熱循環(huán)完成qRT-PCR。引物序列如下：miRNA-224-5p 正義為 5′-TGCCCTAGTGACTACAAAGTCG-3′，反義為 5′-CAGTGCAGGTCCGAGGTAT-3′；U6 正義為5′-CTCGCTTCGGGCAGCACA-3′，反義為 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miRNA-224-5p mimics：5′-UCAAGUCACUAGUGGUUCCGUUUAG-3′，miRNA-224-5p inhibitor：5′-CUAAACGGAACCACUAGUGACUU －GA-3′。以U6為內參，采用 2-ΔΔCt法計算相對表達量。

1.4 MDA-MB-231細胞自噬相關蛋白表達水平檢測 采用免疫印跡試驗。（1）取乳腺癌細胞株MDA-MB-231，以8×104/孔濃度鋪12孔板，每孔加完全培養(yǎng)基1ml；當細胞融合度為60%左右時，換成無血清DMEM培養(yǎng)基，饑餓處理24h，使用Lipofectamine 2000及20nM miRNA-224-5p mimics（空白對照組）、miRNA-224-5p inhibitor（抑制物組）或空質粒（空質粒組）轉染MDAMB-231細胞。（2）轉染后48h收集細胞，對細胞總蛋白進行裂解和純化，取細胞裂解物進行自噬相關蛋白水平檢測，包括 SQSTM1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ等。

1.5 miRNA-224-5p靶基因預測及雙熒光素酶報告基因實驗 采用TargetScan 7.2（http://www.targetscan.org）、MiRDB（http://mirdb.org/miRDB/）在線預測 miRNA-224-5p靶基因。采用雙熒光素酶報告基因實驗檢測miRNA-224-5p的靶基因是否為JAG1。將野生型的JAG1 3′-UTR片段或其突變體（沒有預測的miRNA-224-5p靶序列）分別構建到pmirGLO質粒上，將構建的2種質粒pmirGLO-JAG1野生型或突變型分別與miRNA-224-5p或陰性對照（空載體）共轉染293T細胞；轉染48h后，收集細胞裂解液，采用雙熒光報告實驗系統(tǒng)檢測熒光活力，生物熒光檢測儀分析相對值，即相對熒光強度。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較比較采用SNK-q檢驗；兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-224-5p在乳腺癌血清中的表達 乳腺癌組血清miRNA-224-5p相對表達量為188.51±59.26，明顯高于健康對照組的41.63±14.29，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。這初步表明miRNA-224-5p的表達上調與乳腺癌的發(fā)生存在一定的相關性。

2.2 MDA-MB-231細胞自噬相關蛋白表達水平 抑制miRNA-224-5p表達后，乳腺癌MDA-MB-231細胞SQSTM1蛋白表達水平較空質粒組、空白對照組明顯降低，LC3Ⅰ蛋白表達水平較空白對照組明顯降低，LC3Ⅱ蛋白表達水平較空質粒組、空白對照組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖1和表1。這說明miRNA-224-5p具有抑制乳腺癌細胞自噬活性的作用。

2.3 雙熒光素酶報告基因實驗驗證靶基因 雙熒光素酶報告基因實驗檢測結果顯示，miRNA-224-5p與攜帶JAG1野生型3′-UTR的載體共轉染后，與陰性對照組相比，相對熒光強度明顯降低（P＜0.05）；而缺失靶位點的突變型3′-UTR與miRNA-224-5p共轉染后，與陰性對照組相比，相對熒光強度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2和表2。這表明JAG1是miRNA-224-5p的靶基因。

圖1 3組MDA-MB-231細胞自噬相關蛋白表達的電泳圖

表1 3組MDA-MB-231細胞自噬相關蛋白水平

圖2 生物信息學預測miRNA-224-5p與JAG1結合的靶基因序列

表2 雙熒光素酶報告基因實驗的相對熒光強度

3 討論

乳腺癌是威脅女性健康的常見惡性腫瘤[9]，其在世界范圍內的發(fā)病率持續(xù)增高[10-11]。我國女性乳腺癌發(fā)病率也呈明顯的增長趨勢。因此，開發(fā)新型標志物以早期發(fā)現腫瘤生長情況，實現對乳腺癌患者的早期診斷和個體化治療，是十分重要的工作。近年來，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[12-13]。miRNA在各體液中穩(wěn)定表達且具有腫瘤特異性、高度穩(wěn)定性，提示其作為疾病生物標志物的潛能[14]。miRNA-224-5p是哺乳動物中發(fā)現的一組miRNA前體，位于chrxq28，GABRE基因區(qū)，是一個已知的轉錄靜止區(qū)。已有研究提示，miRNA-224在許多腫瘤中表達異常，可調控與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關的許多關鍵的生物學過程[15-16]。在非小細胞肺癌中，miRNA-224-5p通過靶向RASSF8促進癌細胞的增殖[17]；在骨肉瘤中，miRNA-224-5p參與了腫瘤的發(fā)生等[18]。目前關于miRNA-224-5p是否參與乳腺癌發(fā)生的研究較少。

本研究檢測了miRNA-224-5p在乳腺癌患者血清中的表達，結果發(fā)現較健康對照組明顯升高。同時檢測了乳腺癌MDA-MB-231細胞中 SQSTM1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ等3種自噬蛋白的表達，結果顯示抑制miRNA-224-5p表達后，SQSTM1、LC3Ⅰ蛋白表達明顯降低，LC3Ⅱ表達明顯升高。這說明在乳腺癌患者中miRNA-224-5p的升高伴隨著自噬活性的減弱。此外還發(fā)現在過表達實驗中，miRNA-224-5p對自噬作用無明顯的影響，這可能是miRNA-224-5p在MDA-MB-231細胞中天然高表達的原因。然而在抑制實驗中，miRNA-224-5p水平直接影響細胞自噬水平，miRNA-224-5p可抑制細胞的自噬活性。故本研究初步表明，miRNA-224-5p可通過抑制乳腺癌自噬而參與乳腺癌的進展。

越來越多研究表明，miRNA可通過與腫瘤相關靶蛋白的miRNA結合后，作為促癌因子或抑癌因子參與腫瘤的發(fā)生過程。為了闡明miRNA-224-5p抑制自噬的分子機制，本研究鑒定了可能由miRNA-224-5p調節(jié)自噬途徑中的潛在靶標。首先，通過生物信息學的網絡軟件TargetScan 7.2和MiRDB對miRNA-224-5p的靶基因進行了預測，結果發(fā)現JAG1有2個miRNA-224-5p潛在的結合位點，則推測JAG1為其靶基因。之后通過雙熒光素酶報告基因實驗對預測的靶基因作了進一步驗證。結果顯示miRNA-224-5p可互補結合JAG1的mRNA位點，即JAG1為miRNA-224-5p的靶基因。JAG1基因在染色體上定位于20p12，是5種Notch配體中的一種，屬于DSL蛋白家族，是單次跨膜蛋白，在細胞增殖分化過程中主要通過激活Notch信號通路發(fā)揮作用[19]。有研究表明，阻斷JAG1可以抑制乳腺癌細胞的繼續(xù)分裂，甚至引起細胞死亡，抑制Notch1表達后乳腺癌干細胞微球體的生成數量會下降，并且細胞的侵襲性、腫瘤的繁殖力和侵襲力均會減弱，這些預示著Notch1與乳腺癌細胞的惡性生物學行為密切相關[20-21]。因此，筆者推測miRNA-224-5p可能是靶向JAG1通過Notch信號通路發(fā)揮作用，從而參與乳腺癌的惡性行為。

綜上所述，miRNA-224-5p在乳腺癌患者血清中高表達，在MDA-MB-231細胞中miRNA-224-5p通過靶向JAG1抑制自噬活性。后續(xù)將從分子水平方面進一步驗證miRNA-224-5p與JAG1的直接相互作用，為乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制提供更多的理論依據。