岳菲菲，倪利曉，2，王逸飛，王 娜，劉烜瑜

（1.河海大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210098；2.河海大學(xué) 淺水湖泊綜合治理與資源開(kāi)發(fā)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，

江蘇 南京 210098）

0 引言

人工濕地發(fā)揮凈化作用的三大要素即微生物、水生植物和基質(zhì)[1]，其中濕地微生物是濕地內(nèi)部物質(zhì)轉(zhuǎn)化的主要驅(qū)動(dòng)者，濕地系統(tǒng)的除污能力在一定程度上取決于微生物的種群結(jié)構(gòu)及其多樣性。生物膜大量繁殖，微生物自身在基質(zhì)孔隙中彼此團(tuán)聚、架接。同時(shí)其自身分泌的胞外物質(zhì)不斷在基質(zhì)表面包裹，形成致密不透水層[2]。這些胞外聚合物也極有可能與其他物質(zhì)發(fā)生絡(luò)合作用，降低人工濕地系統(tǒng)的基質(zhì)孔隙度，造成水力傳導(dǎo)系數(shù)的顯著下降[3-5]。在微生物生長(zhǎng)代謝行為中，胞外聚合物主要來(lái)源于微生物分泌、細(xì)胞表面物質(zhì)的脫落、細(xì)胞溶解以及微生物對(duì)周?chē)镔|(zhì)的吸附。胞外聚合物中的有機(jī)組分占比80% ～90%，以多糖、蛋白質(zhì)、核酸為主[6-7]。人工濕地基質(zhì)中提取所得胞外多糖分子由β-糖苷鍵所連接的單糖殘基所組成，是由O-H，C-H，O-H，C-O-C及=CH 等多種官能團(tuán)（對(duì)不同離子表現(xiàn)強(qiáng)烈親和性）組成的復(fù)雜高分子，其分子內(nèi)部及分子間存在大量氫鍵，使其分子間具有較為強(qiáng)烈的作用力。ZHAO Lei-hong 等[8]認(rèn)為胞外聚合物可以通過(guò)其表面負(fù)電性影響靜電反應(yīng)和氫鍵等反應(yīng)，對(duì)污泥性質(zhì)產(chǎn)生重要影響。β-葡聚糖酶主要來(lái)源于微生物[9]，是一類(lèi)能特異作用于β-葡聚糖，降解β-1，3-糖苷鍵、β-1，4-糖苷鍵的水解酶，可使多糖改性增溶，具體表現(xiàn)為粘性和親水性喪失[5，10]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究β-葡聚糖酶對(duì)人工濕地反應(yīng)器中胞外多糖的酶解的影響，嘗試通過(guò)降低胞外多糖的積累量，從而切斷人工濕地填料堵塞的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，為緩解人工濕地堵塞狀況提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置

設(shè)置圓形單元垂直流人工濕地反應(yīng)器。其由高度100 cm，內(nèi)徑45 cm 的均質(zhì)塑料桶加工而成。桶底為集水區(qū)，填充層由下至上分別為： ①厚度為5 cm 的礫石（粒度為d50=15 mm）；②厚度為60 cm 的粗砂（粒度為d10=0.5 mm，d50=2 mm，不均勻系數(shù)Cu=4.2）。3 組PVC 取樣管（帶閥門(mén)）垂直設(shè)置在反應(yīng)器側(cè)壁（距填料層頂端距離分別為5 cm/25 cm/45 cm）。濕地植物選用香蒲，栽種密度為10 株/m2。實(shí)驗(yàn)進(jìn)水經(jīng)由反應(yīng)器頂部的穿孔布水管均勻分配進(jìn)入濕地基質(zhì)層。桶底設(shè)置出水口，由豎直帶閥PVC 管（高度=60 cm）進(jìn)行系統(tǒng)的水位控制。

1.2 基質(zhì)取樣點(diǎn)的設(shè)置

實(shí)驗(yàn)所需的基質(zhì)樣品通過(guò)柱狀土壤采樣器采集，所得樣品用于胞外多糖含量測(cè)定。采樣點(diǎn)分別位于以表面基質(zhì)中心及中心距反應(yīng)器側(cè)壁中點(diǎn)處為起點(diǎn)垂直深入基質(zhì)層內(nèi)部10，30 及50 cm 處。為了使同一橫剖面上所采取的樣品能夠反應(yīng)其真實(shí)的胞外多糖含量，故以反應(yīng)器中點(diǎn)為圓心的同心圓法采取所需樣品，半徑分別為反應(yīng)器半徑的1/2 及1/4，取樣點(diǎn)位于圓心及圓周與經(jīng)過(guò)圓心的2 條相互垂直的軸線的交點(diǎn)處，并以所采取樣品的平均值表征胞外多糖含量。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及測(cè)定方法

1.3.1 胞外多糖的提取、純化

量取0.5 g 基質(zhì)顆粒樣品，采取水浴加熱法從基質(zhì)顆粒表面提取胞外多糖[11]。采用Sevga 法[12]去除胞外多糖濃縮液中的蛋白質(zhì)。得到脫蛋白粗多糖提取物后，經(jīng)洗脫后，收集洗脫液以苯酚-硫酸法[11]測(cè)定吸光度，合并洗脫液移入截留相對(duì)分子質(zhì)量為3 500的透析袋中流水透析48 h 后于-50 ℃下冷凍干燥，得到精制多糖，儲(chǔ)存于聚乙烯塑料品種待后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3.2 還原糖測(cè)定

還原糖含量采取3，5-二硝基水楊酸比色法（DNS 法）[13]測(cè)定。

1.3.3 酶解影響因素的實(shí)驗(yàn)研究及條件優(yōu)化

β-葡聚糖酶購(gòu)自Aladdin Industrial Corporation。

（1）底物濃度對(duì)β-葡聚糖酶降解作用的影響

向各試管中依次加入0.5 mL 質(zhì)量濃度分別為0.2，0.8，1.0，1.5，2.0，2.4，2.8，3.2，3.6，4.0 mg/mL 的糖溶液，預(yù)熱至50 ℃，加稀釋后酶液0.1 mL，pH 值為中性的緩沖液0.4 mL，50 ℃水浴10 min，用DNS中止反應(yīng)，煮沸5 min；同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，反應(yīng)結(jié)束后于540nm 下測(cè)定吸光度值（即光密度值OD540），計(jì)算還原性糖質(zhì)量濃度[14]。

（2）酶質(zhì)量濃度對(duì)β-葡聚糖酶降解作用的影響加入0.5 mL 一定質(zhì)量濃度的糖溶液，預(yù)熱后依次加入0.1 mL 質(zhì)量濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0 mg/mL 的β-葡聚糖酶溶液，其余反應(yīng)條件同（1）所述，計(jì)算還原性糖質(zhì)量濃度。

（3）pH 值對(duì)β-葡聚糖酶降解作用的影響

加入0.5 mL 一定質(zhì)量濃度的糖溶液，預(yù)熱后加入稀釋后的酶液0.1 mL，向各個(gè)試管中依次加入0.4 mL pH 值 分 別 為3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5，8 的緩沖液，其余反應(yīng)條件同（1）所述，計(jì)算還原性糖質(zhì)量濃度。

（4）溫度對(duì)β-葡聚糖酶降解作用的影響

加入0.5 mL 一定質(zhì)量濃度的糖溶液，預(yù)熱后加入稀釋后的酶液0.1 mL，加入pH 值為中性的緩沖液0.4 mL，分別在溫度為25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75 ℃下反應(yīng)，反應(yīng)條件同（1）所述，計(jì)算還原性糖質(zhì)量濃度。

（5）酶解時(shí)間對(duì)β-葡聚糖酶降解作用的影響

取一定質(zhì)量濃度的酶液和糖溶液在固定條件下（糖質(zhì)量濃度為2.8mg/mL，酶液質(zhì)量濃度為1.2mg/mL，反應(yīng)溫度為50 ℃，體系初始pH 值為5.5）反應(yīng)1，10，20，30，40，50，60，90 min，計(jì)算還原性糖質(zhì)量濃度。

（6）β-葡聚糖酶酶解的條件優(yōu)化

為了使反應(yīng)條件達(dá)到最佳，得到最高的還原性糖得率，在以上單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以底物中糖質(zhì)量濃度(A)(mg/mL)、酶質(zhì)量濃度(B)(mg/mL)、溫度(C)(℃)、pH 值（D）(無(wú)量綱）為實(shí)驗(yàn)因素，進(jìn)行4 因素3水平的正交試驗(yàn)：①實(shí)驗(yàn)因素與因素水平見(jiàn)表1；②此處有4 個(gè)3 水平因素，可以選用L9（34）或L27（313）正交實(shí)驗(yàn)表；因本實(shí)驗(yàn)僅考察4 個(gè)因素對(duì)還原糖得率的作用情況，對(duì)因素間的交互作用不進(jìn)行考察，故宜選用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)表；③實(shí)驗(yàn)此處不考察因素間的交互作用，可將A，B，C，D 依次安排在L9（34）的第1，2，3，4 列上；④實(shí)驗(yàn)方案見(jiàn)表2。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平

表2 實(shí)驗(yàn)方案

2 結(jié)果與討論

2.1 底物質(zhì)量濃度對(duì)β-葡聚糖酶降解胞外多糖作用的影響

胞外多糖在β-葡聚糖酶的作用下，β-1，3-糖苷鍵和β-1，4-糖苷鍵斷裂，水解為寡糖或還原性糖，見(jiàn)圖1。從圖1 中可知，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始隨底物質(zhì)量濃度增加，還原糖得率不斷增加；當(dāng)還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加至63.33%時(shí)，底物質(zhì)量濃度再繼續(xù)增加，還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。據(jù)此判斷最適底物質(zhì)量濃度范圍為2.4 ～3.2 mg/mL，此段還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高；2.8 mg/mL 為最適底物質(zhì)量濃度，此時(shí)還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最高值。還原糖得率呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)主要可能因?yàn)榈孜镔|(zhì)量濃度增大的同時(shí)，反應(yīng)體系的黏度也在增大，影響了底物與酶的接觸，另一方面是因?yàn)槊噶恳欢〞r(shí)，底物濃度達(dá)到飽和。

圖1 糖質(zhì)量濃度對(duì)還原性糖得率的影響

2.2 酶質(zhì)量濃度對(duì)β-葡聚糖酶降解胞外多糖的影響

酶質(zhì)量濃度對(duì)酶解產(chǎn)物還原性糖得率的影響見(jiàn)圖2。從圖2 中可知，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，酶質(zhì)量濃度相對(duì)較小，底物相對(duì)充足，隨β-葡聚糖酶質(zhì)量濃度的增加，還原糖得率迅速上升；而當(dāng)酶質(zhì)量濃度增加到一定程度時(shí)，酶分子幾近飽和，此時(shí)還原糖得率不再增加。最適酶質(zhì)量濃度范圍為0.8 ～1.6 mg/mL，此時(shí)還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈增加趨勢(shì)且增長(zhǎng)趨勢(shì)逐緩。酶質(zhì)量濃度在1.2 ～1.6 mg/mL 范圍內(nèi)時(shí)，還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增長(zhǎng)幅度極小，且在酶質(zhì)量濃度達(dá)到1.6 mg/mL以后，還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增長(zhǎng)幅度幾乎為0，綜合考慮酶質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL 時(shí)最為合適。

圖2 酶質(zhì)量濃度對(duì)酶解產(chǎn)物還原性糖得率的影響

從理論上解釋?zhuān)３址磻?yīng)體系中其他成分不變，隨著β-葡聚糖酶質(zhì)量濃度增加，其與底物多糖接觸機(jī)會(huì)同步提升，更多的大分子的葡聚糖被水解成小分子低聚糖，而小分子低聚糖粘度小，填料間粘滯作用減弱，濕地的孔隙率和水力停留時(shí)間也會(huì)分別隨之增大和減小但當(dāng)酶濃度增加至一定水平，酶分子逐漸被飽和，水解速度就會(huì)變緩。

2.3 pH 值對(duì)β-葡聚糖酶降解胞外多糖的影響

pH 值對(duì)β-葡聚糖酶降解胞外多糖的影響見(jiàn)圖3。由圖3 可知，pH 值范圍在5 ～6.5 時(shí)，還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，pH 值為5.5 時(shí)，還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大值45.21%，此時(shí)為最適pH 值。還原糖得率出現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)且兩端還原糖得率極低的情況主要是由于pH 值低于或超過(guò)酶活性范圍時(shí)，酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度改變，引起酶的活性降低。

圖3 pH 值對(duì)酶解產(chǎn)物還原性糖得率的影響

對(duì)酸堿的敏感性是酶的生物學(xué)特性之一，環(huán)境pH 值的變化能夠被酶快速響應(yīng)，活性和穩(wěn)定性隨之受到影響。pH 值對(duì)酶的活性的顯著影響主要通過(guò)改變酶的肽鏈構(gòu)象、氨基酸殘基微環(huán)境造成，同一種酶在不同的pH 值下所表現(xiàn)的活性會(huì)產(chǎn)生差異，超出最適范圍都將影響酶活性。

2.4 溫度對(duì)β-葡聚糖酶降解胞外多糖的影響

溫度對(duì)β-葡聚糖酶降解胞外多糖的影響見(jiàn)圖4。

圖4 溫度對(duì)酶解產(chǎn)物還原性糖得率的影響

從圖4 中可知，溫度范圍為45 ～55 ℃時(shí)，還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高；溫度為50 ℃時(shí)，還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大值47.52%，此時(shí)溫度為最適值。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始隨溫度增加，還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，表示此段隨溫度的升高，酶活性同步增加。但當(dāng)體系上升到一定溫度，超過(guò)酶的最適活性范圍時(shí)，就會(huì)對(duì)酶有破壞作用，造成酶的活性減小，還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。

溫度對(duì)酶的活性影響[15]主要體現(xiàn)在：溫度的變化會(huì)直接影響酶蛋白活化分子的數(shù)目。低溫時(shí)，酶蛋白活化分子數(shù)目少，反應(yīng)速度維持在較低水平；隨著溫度升高，酶促反應(yīng)加快；相應(yīng)地，酶蛋白的變性速度加快，直至溫度上升至某一點(diǎn)后，在酶蛋白的熱變性作用下，酶蛋白活化分子數(shù)會(huì)急劇減少，反應(yīng)速度會(huì)迅速下降。

2.5 酶解時(shí)間對(duì)β-葡聚糖酶降解胞外多糖的影響

酶解時(shí)間對(duì)β-葡聚糖酶降解胞外多糖的影響見(jiàn)圖5。由圖5 可知，不同水解時(shí)間對(duì)還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的有一定影響，反應(yīng)時(shí)間1 min 時(shí)，由于時(shí)間太短，底物與酶接觸不充分，反應(yīng)不完全，還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較小，后隨著時(shí)間的增加還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加。反應(yīng)至10 min 時(shí)，還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)趨于穩(wěn)定，自此以后隨時(shí)間的延長(zhǎng)，還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本保持不變。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物還原性糖得率的影響

2.6 β-葡聚糖酶酶解胞外多糖的條件優(yōu)化

為了探究最佳反應(yīng)條件，理清各因素間的主次順序，便于在實(shí)際條件下選擇合適的時(shí)機(jī)進(jìn)行酶解。在以上單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以底物中糖質(zhì)量濃度、酶質(zhì)量濃度、溫度和pH 值為實(shí)驗(yàn)因素，進(jìn)行4 因素3 水平正交試驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析見(jiàn)表3，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析見(jiàn)表4。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

由于F0.05（2，2）= 19.00，F(xiàn)0.01（2，2）= 99.00，從表4中可以看出，底物中糖質(zhì)量濃度的各水平間的差異極顯著，pH 值影響不顯著，酶質(zhì)量濃度和溫度各水平間的差異顯著，相比而言酶質(zhì)量濃度略強(qiáng)。F 檢驗(yàn)法要求選取Se，且希望fe 要大，故在安排實(shí)驗(yàn)時(shí)，適當(dāng)留出些空列會(huì)較好。綜合各因素對(duì)還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，最優(yōu)組合為A1B3C3D1，即反應(yīng)體系中糖質(zhì)量濃度為2.4 mg/mL，酶質(zhì)量濃度為1.4 mg/mL，反應(yīng)溫度為55 ℃，體系pH 值為6 時(shí)，還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高達(dá)到75.02%。

表4 方差分析

3 結(jié)論

（1）隨底物多糖濃度增加，還原糖得率趨勢(shì)呈先升后降，在底物多糖質(zhì)量濃度為2.8 mg/mL 時(shí)，還原糖得率上升至最高63.33%；實(shí)驗(yàn)最初，β-葡聚糖酶質(zhì)量濃度不斷增加，還原糖得率相應(yīng)不斷增加。當(dāng)酶質(zhì)量濃度增加至0.8 mg/mL 時(shí)，還原糖得率的增長(zhǎng)趨勢(shì)變緩，至酶質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL 時(shí)，還原糖得率達(dá)到最高65.15%。酶質(zhì)量濃度在1.2 ～1.6 mg/mL范圍內(nèi)，還原糖得率基本趨于平穩(wěn)。

（2）pH 值、溫度和酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響相對(duì)底物濃度和酶質(zhì)量濃度較低，這3 者中溫度影響作用最大。溫度在45 ～55 ℃之間時(shí)，還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，皆高于42%，還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在溫度為50 ℃時(shí)，達(dá)到最大值47.52%；pH 值的最適范圍在5.0 ～6.5，超出此范圍時(shí)，酶解后還原糖得率都較低，低于3.5 和高于7.5 的時(shí)候，還原糖得率極低；實(shí)驗(yàn)開(kāi)始10 min 之內(nèi)，還原糖得率持續(xù)升高至70%左右，10 min 后，還原糖得率維持穩(wěn)定，基本不再發(fā)生變化。所以理論上酶解在溫度為45 ～55 ℃，pH 值介于5.0 ～6.5 間，持續(xù)反應(yīng)時(shí)間10 min 以上，酶解效果最好。

（3）各水平間的差異顯著性較好的因素有底物中糖質(zhì)量濃度、酶質(zhì)量濃度、溫度。其中底物中糖質(zhì)量濃度的各水平間的差異極顯著，酶質(zhì)量濃度次之，溫度各水平間的差異顯著性最低；根據(jù)顯著性分析，實(shí)際選擇合適投加時(shí)間時(shí)可依上述順序做選擇，主要依據(jù)胞外多糖的累積量，其次為溫度。