潘國(guó)剛, 楊碧秀, 王春芳, 許桂丹, 梁麗娜, 龍紅兵, 鄧益斌

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院, 廣西 百色 533000)

鼻咽癌( Nasopharyngeal carcinoma, NPC)在頭頸部腫瘤中最為高發(fā)，據(jù)世界衛(wèi)生組織的報(bào)道，中國(guó)占全球NPC發(fā)病率的40%，在臨床工作中，由于NPC發(fā)病隱匿，大部分確診時(shí)已處于中晚期，易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高，死亡率急劇上升[1,2]，因此提高早期NPC診斷率及預(yù)后的判斷尤為重要。有關(guān)NPC的生物標(biāo)志物，中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)的腫瘤標(biāo)志專業(yè)委員會(huì)專家推薦將血漿EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)DNA 檢測(cè)作為NPC早期篩查、治療方案制定及預(yù)后判斷的重要指標(biāo)[2]。既往研究表明除EBV外，包括血清乳酸脫氫酶、C反應(yīng)蛋白、甲基化標(biāo)志物、白細(xì)胞介素-8(Interleukin-8 ，IL-8)等可作為NPC特異性的生物免疫標(biāo)志物，其中IL-8是一種由巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等多種細(xì)胞所產(chǎn)生的一種趨化因子，是多種癌癥發(fā)生發(fā)展的重要免疫調(diào)節(jié)因子[2]。IL-8的表達(dá)水平與NPC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)發(fā)生，作為中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和T細(xì)胞的趨化因子，在急性炎癥反應(yīng)的發(fā)生和遷移中起著關(guān)鍵作用[3,4]。而IL-8基因寡核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNPs)在NPC患者中的研究結(jié)果尚不清楚[3,5]。本文通過(guò)NPC患者進(jìn)行病例對(duì)照研究，評(píng)估IL-8 SNPs及其表達(dá)水平對(duì)NPC易感性的診斷價(jià)值，為臨床更精準(zhǔn)的治療NPC患者提供靶向治療位點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1一般資料:收集我院住院的NPC患者168例，以及同期體檢健康人群232例為對(duì)照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：病理檢測(cè)確診為鼻咽癌，所有患者進(jìn)行放、化療治療，血化驗(yàn)診療資料完整；排除標(biāo)準(zhǔn)：存在其他系統(tǒng)疾病，如心腦肺、血液系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重感染、風(fēng)濕免疫感染疾?。皇占醒芯繉?duì)象的臨床及病理資料，包括年齡、性別、吸煙、飲酒、EBV感染情況。

1.2IL-8基因型多態(tài)性及血清IL-8表達(dá)水平檢測(cè):抽取所有研究對(duì)象的血液樣本，應(yīng)用試劑盒提取DNA，利用聚合酶鏈反應(yīng)-限制片段長(zhǎng)度多態(tài)(PCR-RFLP)方法對(duì)IL-8基因-251、+781、+1633及+2767位點(diǎn)進(jìn)行基因分析，引物序列為：IL-8-251位點(diǎn)：正向：5'-TCATCCATGATCTTGTTCTA-3'，反向： 5'-GGAAAACGCTGTAGGTCAGA-3'， IL-8+781：正向5'-CTCTAACTCTTTATATAGGA-3'， 反向5'-GATTGATTTTATCAACAGGC-3'，IL-8+1633：正向5'-CTGATGGAAGAGAGCTCTGT-3'，5'-TGTTAGAAATGCTCTATATT-3，IL-8+2767：正向5'-CCAGTTAAATTTTCATTTCA-3'，反向 5'-CAACCAGCAAGAAATTACTA-3'，PCR循環(huán)條件為：94℃預(yù)變性5min，循環(huán)1次；94℃ 變性30s，35個(gè)循環(huán)；55℃退火30s，72℃延伸30s；最后在72℃延長(zhǎng)10min；IL-8-251、IL-8+781、IL-8+1633 和IL-8+2767位點(diǎn)的長(zhǎng)度分別為524bp、203bp、397bp、222bp，分別用MfeI、EcoRI、NlaII、BstZ17I限制性內(nèi)切酶消化，在2%瓊脂糖上電泳跑膠，條帶分別為(449bp、75bp)、(184bp、19bp)、(234bp、163bp)、(198bp、24bp)，挑取正確條帶進(jìn)行測(cè)序分析[3]；血清IL-8表達(dá)水平檢測(cè)應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)進(jìn)行IL-8水平檢測(cè)，具體步驟參照IL-8檢測(cè)試劑盒嚴(yán)格進(jìn)行(武漢云克隆科技股份有限公司，SEA080Hu)，收集鼻咽癌患者血液血清，加入到提前包被IL-8抗體的96孔酶標(biāo)板中，用生物素標(biāo)記的抗體孵育1h，HRP標(biāo)記孵育30min，最后用酶標(biāo)儀測(cè)96孔內(nèi)的吸光度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，行t檢驗(yàn)；計(jì)量資料以(%)表示，行χ2檢驗(yàn)；以多因素logistic回歸分析比較IL-8 SNPs與NPC易感性的關(guān)系，關(guān)聯(lián)強(qiáng)調(diào)用優(yōu)勢(shì)比(OR)和95%置信區(qū)間(95%CI)及交互作用指數(shù)表示，S>1為正交互，S<1為負(fù)交互，利用工作特征性曲線(ROC)評(píng)價(jià)IL-8表達(dá)水平在NPC的診斷價(jià)值。以P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兩組間一般資料比較:鼻咽癌組(NPC組)168例，健康對(duì)照組(NC組)232例，兩組患者在年齡、性別、飲酒等方面差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩組在吸煙、EBV感染差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2兩組間IL-8基因型分布、等位基因頻率及IL-8表達(dá)水平比較:IL-8 -251位點(diǎn)3種基因型(TT、TA、AA)中TT和TA基因型在NPC中顯著升高，AA基因型在NPC中顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)(P<0.05)，而等位基因T和A在兩組間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；IL-8+781位點(diǎn)3種基因型(CC、CT、TT)、IL-8+1633位點(diǎn)3種基因型(CC、CT、TTT)、IL-8+2767位點(diǎn)3中基因型(AA、AT、TT)及其相應(yīng)的C/T、C/T、A/T等位基因，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；IL-8在NPC的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表1 兩組間人口學(xué)資料特征比較

表2 兩組間IL-8基因型等位基因頻率及表達(dá)水平比較

2.3IL-8-251位點(diǎn)與NPC易感性的多因素logistic回歸分析:IL-8-251位點(diǎn)攜帶TT基因型(OR=1.98，95%CI：1.00～3.82)和TA基因型(OR=1.35，95%CI∶1.01～2.61)患NPC的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高，而攜帶AA基因型(OR=1.76，95%CI：1.02～3.08)患NPC的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 IL-8-251位點(diǎn)基因型與NPC易感性多因素Logistic回歸分析

2.4IL-8-251基因型多態(tài)性在不同因素暴露下對(duì)NPC易感性的交互作用分析:IL-8-251位點(diǎn)SNPs與在吸煙、EBV感染因素下對(duì)NPC易感性存在交互作用，該位點(diǎn)與吸煙(S=0.91)、EBV感染(S=0.82)存在負(fù)交互作用，見表4。

表4 IL-8-251基因型位點(diǎn)SNPs與不同因素在NPC發(fā)生中的交互作用

2.5IL-8水平對(duì)NPC的診斷價(jià)值:根據(jù)血清IL-8水平對(duì)NPC的診斷價(jià)值繪制ROC曲線，IL-8水平的的曲線下面積(AUC)為0.852，其敏感性為86%，特異性為78%，見圖1。

圖1 IL-8水平對(duì)NPC診斷價(jià)值的ROC曲線

3 討 論

NPC發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前病因尚不明確，多為EBV感染及環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，盡管影像學(xué)檢查對(duì)于NPC的診斷具有特異性，但血漿EBV DNA篩查仍是NPC診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[6,7]。隨著影像成像技術(shù)的發(fā)展，個(gè)性化的綜合放化療策略有助于提高生存率，降低毒副作用，廣泛應(yīng)用于人群篩查、預(yù)后預(yù)測(cè)和疾病監(jiān)測(cè)，免疫治療作為一種新型治療方法在多種晚期惡性腫瘤的治療中發(fā)揮著重要作用，已成為除手術(shù)、放化療外的另一種重要的治療手段，在NPC中具有廣闊的應(yīng)用前景[8～10]。

腫瘤組織中的癌細(xì)胞以及癌旁組織的免疫細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞，都會(huì)釋放細(xì)胞因子。IL-8又稱為趨化因子CXCL8，是上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等分泌的細(xì)胞因子。研究表明IL-8基因及SNPs與包括鼻咽癌在內(nèi)的的多種人類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮潛在作用，可作為免疫治療的靶點(diǎn)[11]。IL-8在多種癌組織中高表達(dá)，IL-8過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致疾病進(jìn)展，在低氧微環(huán)境下，IL-8作為一種趨化因子，對(duì)多種細(xì)胞具有趨化及激活作用，在炎癥、免疫反應(yīng)中起到重要的作用，同時(shí)也是一種促血管生成因子，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及中性粒細(xì)胞增殖、存活和逃脫程序性細(xì)胞死亡及侵襲、擴(kuò)散、遷移[3]。 IL-8基因的表達(dá)可通過(guò)以下途徑：①與多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用來(lái)調(diào)節(jié)其表達(dá)；②參與翻譯階段細(xì)胞蛋白的合成；③參與蛋白的翻譯后調(diào)節(jié)作用，可激活I(lǐng)L-8通路相關(guān)上下游序列。IL-8基因位于人類基因組的4q12-q13，由4個(gè)外顯子組成，IL-8基因寡核苷酸多態(tài)性(SNPs)，即啟動(dòng)子區(qū)域-251 T/A、+781 C/T、+1633 C/T和+2767 A/T是否影響IL-8的表達(dá)，以及與NPC的易感性研究，目前研究較少，本研究擬探討IL-8基因型多態(tài)性及其表達(dá)水平對(duì)NPC患者易感性的診斷價(jià)值，以期臨床早期診斷及治療NPC患者。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)IL-8啟動(dòng)子-251 T/A 基因型與NPC易感性有關(guān)，IL-8-251位點(diǎn)攜帶TT基因型和TA基因型患NPC的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高，而攜帶AA基因型患NPC的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低， 在啟動(dòng)子區(qū)域(251A/T)發(fā)生突變，可影響IL-8 基因的轉(zhuǎn)錄異常，導(dǎo)致IL-8基因表達(dá)下降，提示IL-8可能介導(dǎo)感染炎癥作用引起NPC疾病的發(fā)生發(fā)展，本研究的結(jié)果與以往研究存在不一致[3,7]，可能歸因于不同的人群，不同的暴露因素，或相對(duì)較小的樣本量，未來(lái)的研究需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本來(lái)驗(yàn)證該位點(diǎn)多態(tài)性與NPC的發(fā)生的關(guān)聯(lián)性在本研究亦發(fā)現(xiàn)NPC患者中IL-8表達(dá)升高，考慮其與NPC疾病進(jìn)展有關(guān)，且對(duì)NPC的易感性具有診斷價(jià)值。據(jù)報(bào)道，慢性吸煙和EBV感染是鼻咽癌發(fā)生的病因，降低了患者的生存率[12]，與本研究報(bào)道一致，在NPC人群中患者吸煙、EBV感染明顯增多，可能與NPC發(fā)病相關(guān)，但其具體機(jī)制尚不明確，本研究中在吸煙、EBV暴露因素下，IL-8-251位點(diǎn)SNPs與吸煙、EBV感染因素對(duì)NPC易感性存在負(fù)交互作用，可見，IL-8基因多態(tài)性(-251 T/A 基因型)和表達(dá)升高可用來(lái)預(yù)測(cè)NPC疾病復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，可作為評(píng)估NPC治療效果的一個(gè)特異性生物學(xué)指標(biāo)。

綜上所述，IL-8-251基因位點(diǎn)TT基因型和TA基因型患NPC的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高，AA基因型患NPC的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低，且鼻咽癌患者IL-8表達(dá)水平明顯升高，對(duì)NPC易感性具有診斷價(jià)值，IL-8-251位點(diǎn)SNPs與吸煙、EBV感染因素對(duì)NPC易感性存在負(fù)交互作用。因此，IL-8基因型多態(tài)性及表達(dá)水平可用于NPC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和早期診斷，可作為免疫治療一個(gè)有效靶點(diǎn)，在臨床上具有應(yīng)用推廣價(jià)值。